胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术

二、保护措施
诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时 才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。 为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强 制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。 诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方 法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞 的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。
• 超快速冷冻法 超快速冷冻法是把卵母细胞用适当的冷冻保护剂混合液进 行短暂处理后，直接投入液氮中，在冷冻过程中细胞内外 都形成结晶。 • 玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻法是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，主 要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞用玻璃化溶液处理 后，直接投入液氮保存。因为冷冻液在液氮中形成的是一 种非晶体物质状态，因而避免了慢速冷冻过程中细胞所遭 受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理所需的时间，简化了 步骤，也不需要昂贵的程序降温仪，逐渐成为胚胎和卵母 细胞冷冻的趋势。玻璃化液的组成较为复杂，包括丙二醇、 二甲基亚砜、乙酰胺、聚乙二醇等。
历史回顾 冷冻原理 冷冻方法 卵母细胞冷冻保存 胚胎冷冻保存 解冻方法 冷冻效果鉴定 影响冷冻效果的因素 存在问题及展望
历史回顾
1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠 胚胎。 1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细 胞得到活仔。 1977年Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。 1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。 目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效 果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。
冷冻过程 快速冷冻法 由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。 一步冷冻法 牛和山羊目前仍处于试验阶段 牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。 山羊胚胎先在室温下将胚胎移入低于最终浓度或将最终浓 度的保护液对倍稀释的液体中平衡10min，再移入4℃预 冷的最终浓度保护液中，装入细管并在4℃下平衡 10~15min，即可直接或在液氮蒸汽中停留1~2min后投入 液氮 。
非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物，能溶于 水，但不能渗入细胞，较为常 用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。 在快速冷冻时，可协助渗透性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。 其他保护剂 主要是指最近所发现的一些新型 冷冻保护剂，如抗冻蛋白 （AFP）。
使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能 增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的 驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后， 整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化， 避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透 性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。 渗透性保护剂 渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能 够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲 基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类 物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：① 防止细胞因脱水过度收缩；②与水分子发生水合作用，减 慢溶液结晶速度；③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减 少盐害作用的产生。
胚胎及卵母细胞的 冷冻保存技术
概述
• 概念 胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程 序，使胚胎或卵母细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升 温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细 胞的技术。 • 意义 ① 是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之 一。 ② 是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部 分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。
冷冻效果鉴定
胚胎冷冻效果鉴定 冷冻胚胎解冻后要对其活力进行鉴定，才能确定是否适于 移植。 形态学鉴定（显微镜观察是否恢复冻前状态） 染色检查（荧光染色检查有淡绿色荧光、台盼蓝染色不着 色） 培养鉴定 移植实验 卵母细胞冷冻效果鉴定 按一般方法进行培养和体外受精
影响冷冻效果的因素
玻璃化的保护作用 玻璃化是高浓度的冷 冻保护液在低温或超 低温下溶液由液相变 为固相时，其内部的 分子、离子分布不改 变其原有的分布，不 形成有规则外表的物 质形态，可有效避免 冰晶形成时对卵母细 胞内部骨架结构和亚 细胞器膜的牵拉断裂 和尖锐刺伤。
冷冻方法
一、卵母源自文库胞的冷冻 保存
卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵 1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
卵母细胞或胚胎自身 因素 发育阶段 细胞脂肪含量 外围结构 冷冻方法 冷冻保护剂
存在问题和展望
• 利用卵母细胞冷冻保存技术和胚胎冷冻技术可以建立“卵 子库”和“胚子库”，不仅可以解决目前卵母细胞来源短 缺的问题，还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转 基因动物生产不受时间和空间的限制，并且代替家畜的活 体保种和濒危动物遗传种质资源保存。在人类医学上，卵 母细胞的冷冻保存将会为那些由于病理或其它原因造成不 孕的病人提供一个挽救生育的机会。但是，卵母细胞的冷 冻保存仍然存在着许多尚待解决的问题，如卵母细胞对低 温的敏感性很强，冷冻保存后卵母细胞活力、受精率及其 发育能力均明显降低。在不久的将来，随着卵母细胞冷冻 保存技术和胚胎冷冻保存技术的进一步完善和规范，使其 与其它胚胎工程技术相结合，必将在畜牧业生产、生物技 术以及人类医学领域取得新的突破。
二、胚胎冷冻
保护剂的选择和配制 不同动物的胚胎冷冻所用的保护剂种类和浓度各不相同。 牛用1.0~1.5mol/L DMSO、1.0mol/L的甘油或1.5mol/L的 乙二醇、丙二醇效果均好。一步冷冻时常采用两种保护剂 组成的高浓度玻璃化液。 奶山羊胚胎冷冻一般选用1~1.4mol/L（7.3％~10％）甘油。 绵羊用1.5mol/L甘油、DMSO、乙二醇或丙二醇。 马5~7日龄的胚胎一般采用1.0~1.3mol/L的甘油作为保护 剂。
脱出保护剂 目前多采用蔗糖液一步或两步法脱除胚胎里的保护剂，使 胚胎复水。 用PBSS配置成0.2~0.5mol/L的蔗糖液，胚胎解冻后，在 室温（25~26℃）下放入该液体中，保持5~10min，在显 微镜下观察，胚胎扩张至接近冻前状态即认为保护剂已脱 除，然后移入PBSS中准备移植。 一步冷冻的胚胎解冻时一般使用1.0mol/L和0.5mol/L蔗糖 脱除两次后再移入PBSS中的效果较好。 冷冻卵母细胞，要先在25℃水浴中解冻，将细管内含物一 起排入一空培养皿中，5min后把卵母细胞移入0.25mol/L 蔗糖液中，再经5min移入PBS/FCS中，洗涤两次，即完 成解冻过程。
卵母细胞冷冻方法 卵母细胞的冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法、 一步冷冻法、超快速冷冻法和玻璃化冷冻法5种。 慢速冷冻法 此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎 冷冻研究中常用的方法。该法将胚胎置于冷冻保 护液中以0.2~0.8℃/min的速率缓慢降至-80℃， 然后投入液氮保存。利用这一方法先后对多种家 畜和实验动物的胚胎进行冷冻试验并取得成功， 但由于其冷冻过程花费的时间比较长（6h以上）， 而且需要特殊的冷冻降温设备，因此目前已经很 少采用。
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况： （1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间 渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞 内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细 胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜 的分解。 （2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受 到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷冻保 存的关键。
图为世界首例冷冻胚胎克隆水牛“盼盼”（左）与“代孕妈妈”在一起
胚胎的冻前处理 保护剂的加入 大都采用一步法加入保护剂。胚胎移入保护液时温度应为 18~20℃，平衡时间为15~25min。 装管 胚胎冷冻一般采用0.25ml精液冷冻细管。 1. 将细管有棉塞的一端插入装管器。 2. 按保护液（Ⅰ段）→气泡→胚胎和保护液（Ⅱ段）→气泡 →保护液（Ⅲ段）顺序装管。 3. 在实体显微镜下检验胚胎是否装入管内。 4. 封管。
在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充 分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温 度瞬间剧增，造成过冷损伤。 冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要 是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂 损伤。 卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由 于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受 到损伤。 冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳 定性而导致染色体异常。
被冷冻的人工胚胎
存放冷冻胚胎的液氮罐
解冻方法
解冻 快速解冻优于慢速解冻 快速解冻法通常采用温水浴法，以300～360℃/min的速率 使胚胎在30～40s内从-196℃迅速升至室温。即将装有胚 胎的细管由液氮中取出，直接(或在空气中停留5～10s)投 入20～35℃的温水中，轻轻摆动，1min即可完成解冻过 程。
卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级： 1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。 2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有 暗斑。 应筛选A、B级卵母细胞，用于成熟培养和冷冻。
冷冻原理
低温冷冻保存的细胞能长期 保存而不丧失活性，其原因 是因为细胞内一切新陈代谢 过程中的化学反应被低温所 抑制，细胞内所有化学变化 处于一种“暂停”状态而使 细胞得以长期保存。低温保 存的细胞以一定方式复苏后， 又具有存活能力。 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）