胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
冷冻卵子技术
冷冻卵子技术戴致远12307130175简介冷冻卵子，又称雪藏卵子，即取母体健康时的卵子冷冻，阻止卵子随人体衰老，待想生育时取出冷冻的卵子使用即可。
冷冻卵子的技术本身并不成熟，即使可以冷冻、复苏、形成受精卵，胚胎。
主要方式保存卵子有两种方式。
慢速冷冻法，即把卵子储存在脱水的溶液中，然后用电脑系统让它慢慢冷冻起来，最后封存在超冷的液化氮中。
[3]另一种是玻璃化冷冻法，即把卵子放进高浓度渗透液中，然后立即储存到液氮中。
冷冻卵子保存后，待想生育时取出冷冻的卵子，解冻后即可进行体外受精最终获得胚胎。
流程(原理)01试管婴儿登记、体检：我们国家的生殖中心只允许为做试管婴儿的妇女冷冻卵子，如果有多余的卵子，且夫妻双方都同意，也可以进行捐赠。
冷冻卵子之前需要进行相关的身体检查。
02打排卵针、取卵：如果要想取卵，首先要在促性腺激素促卵发育后，给女性打促卵泡成熟的针。
大约36小时后，医生会在B超引导下，经过阴道穿到卵巢内，把卵泡的卵泡液吸出来。
通过B超可以看到，一团透明的像水晶球一样的物质就是卵泡，卵泡中孕育着成熟的卵子。
取卵手术通常不超过10分钟。
03卵泡液送至实验室：医生把卵泡液吸出来至试管中，迅速通过窗口传递到实验室中的显微镜下。
冻卵的过程全部在实验室里进行操作。
卵子很娇气，怕光、怕冷、怕热，所以整个取卵过程，必须在暗环境下迅速完成。
04提取出卵母细胞：卵子细胞悬浮在卵泡液中，实验室的技术人员首先会在显微镜下，把卵泡液中的卵子细胞分离出来。
05卵子脱水：实验室的工作人员把卵子放进高度浓缩的脱水冷冻保护溶液中进行脱水。
06迅速放入有液氮的专用容器中：脱水后的卵子立即投入液氮中，此种方式称之为玻璃化冷冻。
07转移：此时的液氮容器无法永久保存，还需转移至液氮罐中。
08放入液氮罐中：卵子被转移至零下198℃的液氮罐中长期保存，每一份卵子都有相应的编号，便于日后使用。
09使用时进行复温：若干时间后，当妇女需要使用卵子时，专业技术人员从液化氮中取出卵子，复温，用溶液清除掉卵子所用的化学物质。
胚胎冷冻技术
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。 2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。 北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否 发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。 玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法
试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法在辅助生育技术中，最常见的是程序化慢速冷冻法，其次是玻璃化冷冻，较少用的是超快速冷冻，后两者都属于快速冷冻的范畴。
冷冻技术在不同的IVF中心有或多或少的变化，但不同的方法都可获得较好的结局。
这表明冷冻标本可以耐受一定的外界变化，只要这种变化是在细胞可以承受的范围，则细胞可以存活，发育潜能可以维持。
(一)程序化慢速冷冻法通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。
在冷冻仪(图13–2)内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。
由于细胞自身的特性，它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。
程序冷冻仪图13–1程序冷冻仪图13–2在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。
温度休克al shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。
其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过程之间。
这可能是由于细胞膜脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。
卵磷脂被认为有保护作用。
冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。
为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，可通过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。
二是较常用的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。
辅助生殖中常采用的植冰温度是一6℃一– 8℃。
目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景_孙志宏
人类胚胎冷冻保存技术的研究进展与应用前景延安大学生命科学学院(延安716000) 孙志宏 马 莉 周茂林 综述 李延清 审校 1983年Tr ounso n等首先将胚胎的冷冻-解冻技术用于人胚,并成功妊娠[1]。
目前,世界上已普遍开展了胚胎的冷冻和复融技术。
本文就胚胎冷冻技术基本原理、研究进展与应用前景做一综述。
1 胚胎冷冻保存原理及其损伤机制1.1 胚胎冷冻保存原理 冷冻保存(cr yo peserv ation),是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速度降至零下某一温度,对其长期保存的过程[2]。
此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,从而达到长期保存的目的。
胚胎冷冻技术是在精子冷冻保存的基础上发展起来的。
冷冻胚胎存活率是渗透压和低温损害积累结果的反映。
冷冻保护液的浓度和植冰温度之间确定最适宜的关系是保证冷冻胚胎存活的关键因素[1]。
1.2 胚胎冻存的损伤机制 胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程,冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。
正常胚胎细胞内水分含量达80%以上,在冷冻过程中,胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶,一方面对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤(ice damag e),另一方面导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高,造成蛋白质变性即溶液损伤(solutio n damag e),二者最后都导致胚胎不可逆性变化而死亡。
但是,如果在胚胎冷冻保存液中加入一定浓度的冷冻保护剂如甘油、DM SO、乙二醇等,则可大幅度减小冷冻对胚胎的损伤[3-4]。
冷冻保护剂的成分通过细胞膜进入细胞内,细胞内外冷冻保护剂和其它溶质达到平衡,同时细胞脱水形成玻璃化的凝固状态,该过程是胚胎冷冻最重要的保护机制。
解冻时,冷冻保护剂渗出细胞外,同时细胞膜必须防止水过多过快渗人细胞内,以免发生渗透性膨胀。
2 冷冻保护剂的种类极其作用机制 在胚胎冷冻和解冻过程中的适当阶段添加适当浓度的冷冻保护剂能有效地降低对细胞的损伤,科学选用冷冻保护剂在胚胎冷冻保存过程中非常重要[5]。
2022女性生育力保存技术全文
2022女性生育力保存技术（全文）随着全球生育力呈现出明显下降的趋势，中国的生育力下降也已经成为比较严重的社会问题。
女性肿瘤患者的一些相关治疗，例如化疗、盆腔放疗、造血干细胞移植、涉及卵巢的手术治疗都可能对生育力造成显著的损伤。
而非肿瘤疾病，主要涉及顽性免疫性疾病、需造血干细胞移植的良性血液性疾病、早发性卵巢功能不全（prematureovarian insufficiency , POI）相关疾病,虽然只占女性生育力保存需求的8%~19% ,但仍然值得我们关注。
目前女性生育力保存相关技术主要涉及胚胎冷冻、卵子冷冻、卵巢组织冷冻及相关衍生技术如卵母细胞体外成熟、卵泡培养等。
1胚胎冷冻及卵子冷冻冻融胚胎移植技术已存在30余年，目前冻融胚胎移植与新鲜胚胎移植妊娠率无明显差别，是已婚育龄女性进行生育力保存的有效方法。
根据国内外生育力保存指南建议，卵母细胞冷冻保存和胚胎冷冻保存一样，都是生育力保存的一线治疗方案，主要针对无配偶的未婚女性。
在我国，胚胎冷冻和卵子冷冻均是以玻璃化为主流的冷冻方法，已经基本代替了程序冷冻法。
对于安全性，从目前的研究随访结果来看，冻融胚胎移植周期除文献报道可能出现新生儿体重高于新鲜胚胎移植外，围产期母儿并发症及新生儿出生缺陷并没有明显的增加。
根据《冷冻胚胎保存时限的中国专家共识》，胚胎冷冻6年内不影响妊娠结局，但尚无足够证据证实胚胎冷冻保存时间超过6年对冻融胚胎移植安全性有影响。
目前也无证据表明长期保存玻璃化冷冻卵子存在安全性问题。
女性卵子冷冻时的年龄与活产率密切相关，35岁以下女性冷冻卵子的活产率随着冷冻卵子数的增多而持续增高，大于35岁女性冷冻卵子累计到20枚其活产率将不再增加。
2卵巢组织冷冻卵巢组织冷冻适用于青春期前的儿童或需紧急生育力保存的患者。
对于已接受化疗的患者，相较于胚胎冷冻与卵子冷冻而言，更推荐选择卵巢组织冷冻，其原因是化疗对于分裂活跃的细胞具有更加明显的毒性作用，而对始基卵泡相对不敏感。
动物繁殖调控技术+
相关延伸技术（胚胎冷冻、性别鉴定、胚
胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植和基因导入 等）
一、人工受精技术
（Artificial Insemination,AI）
1、历史研究 1780年，意大利Spallanzani首次用犬进行人工受精，获得 成功; 1899年，俄国伊万诺夫进行马和牛的AI工作，将犬的假 阴道改进成了马、牛、羊用假阴道，并研究精液处理方 法，使AI技术进入实际应用阶段; 1951年，英国人Polge等将甘油用于-79℃超低温冷冻保存 牛精液并输精，同年产下世界第一头冷冻精液牛犊; 1952年，Polge又发表了用经液氮在-192℃保存9个月鸡精 液的受精卵孵化出了雏鸡的报告
二、MOET技术
3、受体同期发情处理
同期发情是利用某些外源激素人为控制并调 整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时 间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移 植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。 当前常用的激素药物有PMSG、GnRH、LHRH、 FSH、LH、hCG、PGF2α 、P4及类似物等。在牛上 常 用 二 次 PGF2α , 一 般 注 射 后 36-48h, 有 45% ～ 60%母牛均表现发情。
动物繁殖调控技术
人为地调控动物的 生殖活动，提高动物生 产的效益和质量，使之 适合于人们经济发展与 维持生态平衡的需要， 要求人们加速发展经济 动物、观赏动物及保护 濒危动物，这些促进了畜牧兽医工作者对动物生 殖进行有效了调控，充分发挥动物的生殖潜力， 提高繁殖效率，使之进一步满足人民生活在社会 发展的需求。
二、MOET技术
2.2人工授精
两次授精,以增加获得受精卵母细胞的机会。 动物一般在停药后24-48h内有95%的母畜均表现 发情。一般上、下午各输1次, 因母畜为超排处 理.有多个卵子排出，而需加大输精量.用原精的 0. 2 ml(含4亿精子)/次。如第二次授精时供体 牛仍处于发情状态,则须在8～12h后再进行第三 次授精。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NYT1900-2010
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
卵母细胞的冷冻技术概要
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
哺乳动物卵母细胞与胚胎冷冻保存的研究进展
随 着胚 胎 工 程技 术 和低温 生 物 学 的不 断进 步 ， 研 究人 员对 哺乳动 物 的生殖 细胞 和组 织的冷 冻保 存 作 了大量 的研究 。卵母 细胞 与胚 胎 的冷冻保 存 是胚 胎 生 物技术 的重 要组 成部 分 ， 不仅 可为体 外受 精 、 它 核移 植 、 胎移 植 、 基 因动物 研究 等胚胎 工程 技术 胚 转 提供具 有发 育能 力 的 卵母 细胞 和 胚 胎 ， 而且 可 以与 精液 冷冻保 存一 起 建 立 种 质 资源 库 ， 为有 价 值 的雌 性 个体 和珍 稀濒危 野 生动物 的遗 传资源 的长期 保存 提 供新 的途径 ， 而不 受时 间和 空间 的限制 。 从
（ 而不 是 ２ ～２ ℃ ） 最 显著 的结果 是 断奶 时仔 猪 的 ６ ８ ， 体 重与对 照组 不 同。母 猪在 环境 温度相 对较 低 的环 境 中进 行 分 娩 后 ， 产 仔 猪 在 断奶 时 体 重 达 到 了 所 ８ ５千克 ， ． 而对 照组 母 猪所 产仔 猪 的断 奶 体重 仅 为 ７ ９千克 。 由于两 组母 猪 哺 乳 期 的 失 重 相 同 ， 究 ． 研 人员对 此解 释是 ， 比较 凉 爽 环 境 中 的母 猪 必 然增 在 加 了采食 量从 而增 加 了 自身的泌 乳量 同时 又没有丧 失 更 多的体重 。试 验结 果 见表 ｌ 。
需要 用较 少 的能量来 对 猪圈进行 加温 。 还 ５欧 元 尚需 回收 。 因此 ， Ｓｅｋｅ 中心 的 按 ｔｒｓｌ
推断 ， 要使 该项 改进技 术能 够在 经济上 获得 好处 ， 每
头母 猪 每年获 得 的利 润增 长就 要高 于这个 数 。为 了
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读PPT课件
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
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历史回顾 冷冻原理 冷冻方法 卵母细胞冷冻保存 胚胎冷冻保存 解冻方法 冷冻效果鉴定 影响冷冻效果的因素 存在问题及展望
历史回顾
1972年，Whittingham等首次用慢速冷冻法成功保存小鼠 胚胎。 1977年，Whittingham再次报道了冷冻、解冻小鼠卵母细 胞得到活仔。 1977年Willadsen进行了改良，建立了快速冷冻法。 1985年Rail和Fahy建立了玻璃化冷冻法。 目前，胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术研究集中于寻求效 果更佳的保护剂和简化冷冻和解冻程序方面。
使用冷冻保护剂 冷冻保护剂作用原理：当冷冻保护剂渗入到细胞内后，能 增加整个细胞的粘度和细胞内的溶质浓度，使冰晶生长的 驱动力减弱，减少冰晶的形成。在浓度增加到一定程度后， 整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化， 避免“胞内冰晶损伤”。此外，保护剂可改变细胞膜通透 性，降低细胞内外渗透压差，避免“溶质性损伤”。 渗透性保护剂 渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能 够渗透进入胞质内而得名，常用的有甘油（GL）、二甲 基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇等(EG)。该类 物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：① 防止细胞因脱水过度收缩；②与水分子发生水合作用，减 慢溶液结晶速度；③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减 少盐害作用的产生。
被冷冻的人工胚胎
存放冷冻胚胎的液氮罐
解冻方法
解冻 快速解冻优于慢速解冻 快速解冻法通常采用温水浴法，以300～360℃/min的速率 使胚胎在30～40s内从-196℃迅速升至室温。即将装有胚 胎的细管由液氮中取出，直接(或在空气中停留5～10s)投 入20～35℃的温水中，轻轻摆动，1min即可完成解冻过 程。
玻璃化的保护作用 玻璃化是高浓度的冷 冻保护液在低温或超 低温下溶液由液相变 为固相时，其内部的 分子、离子分布不改 变其原有的分布，不 形成有规则外表的物 质形态，可有效避免 冰晶形成时对卵母细 胞内部骨架结构和亚 细胞器膜的牵拉断裂 和尖锐刺伤。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻 保存
卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵 1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级： 1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。 2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有 暗斑。 应筛选A、B级卵母细胞，用于成熟培养和冷冻。
冷冻过程 快速冷冻法 由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。 一步冷冻法 牛和山羊目前仍处于试验阶段 牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。 山羊胚胎先在室温下将胚胎移入低于最终浓度或将最终浓 度的保护液对倍稀释的液体中平衡10min，再移入4℃预 冷的最终浓度保护液中，装入细管并在4℃下平衡 10~15min，即可直接或在液氮蒸汽中停留1~2min后投入 液氮 。
冷冻原理
低温冷冻保存的细胞能长期 保存而不丧失活性，其原因 是因为细胞内一切新陈代谢 过程中的化学反应被低温所 抑制，细胞内所有化学变化 处于一种“暂停”状态而使 细胞得以长期保存。低温保 存的细胞以一定方式复苏后， 又具有存活能力。 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）
二、保护措施
诱发结晶 溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温时 才结晶，这种现象叫过冷现象，易对卵母细胞造成损伤。 为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强 制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈的温度变化。 诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发方 法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞 的冷冻液上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。
二、胚胎冷冻
保护剂的选择和配制 不同动物的胚胎冷冻所用的保护剂种类和浓度各不相同。 牛用1.0~1.5mol/L DMSO、1.0mol/L的甘油或1.5mol/L的 乙二醇、丙二醇效果均好。一步冷冻时常采用两种保护剂 组成的高浓度玻璃化液。 奶山羊胚胎冷冻一般选用1~1.4mol/L（7.3％~10％）甘油。 绵羊用1.5mol/L甘油、DMSO、乙二醇或丙二醇。 马5~7日龄的胚胎一般采用1.0~1.3mol/L的甘油作为保护 剂。
卵母细胞冷冻方法 卵母细胞的冷冻方法有慢速冷冻法、快速冷冻法、 一步冷冻法、超快速冷冻法和玻璃化冷冻法5种。 慢速冷冻法 此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎 冷冻研究中常用的方法。该法将胚胎置于冷冻保 护液中以0.2~0.8℃/min的速率缓慢降至-80℃， 然后投入液氮保存。利用这一方法先后对多种家 畜和实验动物的胚胎进行冷冻试验并取得成功， 但由于其冷冻过程花费的时间比较长（6h以上）， 而且需要特殊的冷冻降温设备，因此目前已经很 少采用。
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况： （1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间 渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞 内外形成了较高的渗透压差，使细胞内水分逐渐减少，细 胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜 的分解。 （2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受 到物理性的损伤。这个因素影响是胚胎及卵母细胞冷冻保 存的关键。
脱出保护剂 目前多采用蔗糖液一步或两步法脱除胚胎里的保护剂，使 胚胎复水。 用PBSS配置成0.2~0.5mol/L的蔗糖液，胚胎解冻后，在 室温（25~26℃）下放入该液体中，保持5~10min，在显 微镜下观察，胚胎扩张至接近冻前状态即认为保护剂已脱 除，然后移入PBSS中准备移植。 一步冷冻的胚胎解冻时一般使用1.0mol/L和0.5mol/L蔗糖 脱除两次后再移入PBSS中的效果较好。 冷冻卵母细胞，要先在25℃水浴中解冻，将细管内含物一 起排入一空培养皿中，5min后把卵母细胞移入0.25mol/L 蔗糖液中，再经5min移入PBS/FCS中，洗涤两次，即完 成解冻过程。
非渗透性保护剂 这是一类大分子化合物，能溶于 水，但不能渗入细胞，较为常 用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。 在快速冷冻时，可协助渗透性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。 其他保护剂 主要是指最近所发现的一些新型 冷冻保护剂，如抗冻蛋白 （AFP）。
• 超快速冷冻法 超快速冷冻法是把卵母细胞用适当的冷冻保护剂混合液进 行短暂处理后，直接投入液氮中，在冷冻过程中细胞内外 都形成结晶。 • 玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻法是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，主 要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞用玻璃化溶液处理 后，直接投入液氮保存。因为冷冻液在液氮中形成的是一 种非晶体物质状态，因而避免了慢速冷冻过程中细胞所遭 受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理所需的时间，简化了 步骤，也不需要昂贵的程序降温仪，逐渐成为胚胎和卵母 细胞冷冻的趋势。玻璃化液的组成较为复杂，包括丙二醇、 二甲基亚砜、乙酰胺、聚乙二醇等。
卵母细胞或胚胎自身 因素 发育阶段 细胞脂肪含量 外围结构 冷冻方法 冷冻保护剂
存在问题和展望
• 利用卵母细胞冷冻保存技术和胚胎冷冻技术可以建立“卵 子库”和“胚子库”，不仅可以解决目前卵母细胞来源短 缺的问题，还可以使其它生物技术如体外受精、克隆和转 基因动物生产不受时间和空间的限制，并且代替家畜的活 体保种和濒危动物遗传种质资源保存。在人类医学上，卵 母细胞的冷冻保存将会为那些由于病理或其它原因造成不 孕的病人提供一个挽救生育的机会。但是，卵母细胞的冷 冻保存仍然存在着许多尚待解决的问题，如卵母细胞对低 温的敏感性很强，冷冻保存后卵母细胞活力、受精率及其 发育能力均明显降低。在不久的将来，随着卵母细胞冷冻 保存技术和胚胎冷冻保存技术的进一步完善和规范，使其 与其它胚胎工程技术相结合，必将在畜牧业生产、生物技 术以及人类医学领域取得新的突破。
图为世界首例冷冻胚胎克隆水牛“盼盼”（左）与“代孕妈 大都采用一步法加入保护剂。胚胎移入保护液时温度应为 18~20℃，平衡时间为15~25min。 装管 胚胎冷冻一般采用0.25ml精液冷冻细管。 1. 将细管有棉塞的一端插入装管器。 2. 按保护液（Ⅰ段）→气泡→胚胎和保护液（Ⅱ段）→气泡 →保护液（Ⅲ段）顺序装管。 3. 在实体显微镜下检验胚胎是否装入管内。 4. 封管。
胚胎及卵母细胞的 冷冻保存技术
概述
• 概念 胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程 序，使胚胎或卵母细胞在-196℃的条件下停止代谢，而升 温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细 胞的技术。 • 意义 ① 是保护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之 一。 ② 是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部 分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。
在-5~-15℃细胞内液处于超冷冻状态时，如果细胞尚未充 分脱水，一旦结冰，冰晶就会迅速聚集，释放潜热引起温 度瞬间剧增，造成过冷损伤。 冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要 是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂 损伤。 卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由 于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受 到损伤。 冷冻还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA的不稳 定性而导致染色体异常。