细胞传代标准操作规程版
细胞传代标准操作流程
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细胞传代操作步骤
细胞传代操作步骤细胞传代呀，就像是一场细胞世界的接力赛！咱就来好好唠唠这个操作步骤。
先得准备好比赛场地呀，也就是超净工作台啦，把它收拾得干干净净，可不能有啥灰尘杂质来捣乱。
然后把咱要用的那些瓶瓶罐罐、吸管啥的都放进去，消消毒，这就好比给运动员们准备好崭新的运动装备。
接下来，就该主角细胞们登场啦！把培养瓶从培养箱里小心翼翼地拿出来，就像迎接冠军队伍一样。
看看细胞们长得咋样啦，如果它们已经密密麻麻地挤在一起，就像人多到快没地方站了，那就是该传代的时候啦。
这时候，就得来点温柔的操作啦。
先用吸管把培养液吸出来，这可不能太粗鲁，不然会伤到细胞宝宝们的。
吸完培养液，再给它们洗个澡，加点缓冲液轻轻晃一晃，把那些杂质啥的都冲掉。
然后呢，就该给细胞们分家啦！可以用胰酶来帮忙，就像个温柔的分割大师。
把胰酶加进去，让细胞们稍微泡一泡，等它们松松地贴在瓶底上，就可以开始下一步啦。
轻轻拍打培养瓶，让细胞们都松动起来，这感觉就像是给运动员们喊加油，让他们活动活动筋骨。
然后再用吸管把细胞们吸起来，分成一小份一小份的，就像把大队伍分成一个个小团队。
把分好的细胞们放进新的培养瓶里，给它们加上新鲜的培养液，这就好比给运动员们准备好充足的能量和营养。
把培养瓶放好，送回培养箱里，让细胞们继续茁壮成长。
你说这细胞传代是不是很有意思呀？就像一场精心安排的比赛，每个环节都不能出错呢。
要是操作不当，细胞们可不高兴啦，说不定就长不好啦。
所以呀，咱得细心细心再细心，就像照顾宝贝一样照顾这些细胞们。
细胞传代可不只是个简单的操作，它关系到细胞能不能健康生长，能不能为我们的实验提供有力的支持呢。
每次做细胞传代的时候，都感觉自己像是个细胞世界的魔法师，掌握着细胞们的命运。
大家可别小瞧了这个过程哦，它可是很多实验的基础呢。
只有把细胞传代做好了，才能让细胞们好好发挥作用呀。
就好比只有运动员们状态好，才能在比赛中取得好成绩一样。
总之呢，细胞传代是个既有趣又重要的操作，大家可得好好掌握呀！让我们一起在细胞的世界里愉快地玩耍吧！。
细胞传代标准操作规程
细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞倍增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。
（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将实验所需培养基置37℃下预热。
3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞传代具体操作(1)
一、生物安全柜的操作规程1.进入细菌、细胞间进行实验，必须穿上白大褂和乳胶手套，才能开始后续所有实验操作。
2. 生物安全柜内必备用品：酒精灯、打火机、1000μl枪、200μl枪、200μl枪头一盒、1000μl枪头一盒、移液枪、擦台面的泡有棉球的酒精瓶、装有EP管的瓶子、镊子、记号笔、细胞培养瓶（最多一袋）。
3. 开启紫外灯灭菌之前，请用酒精棉球擦拭台面，并且注意检查如下几点：准备一个废液缸，放入生物安全柜中；移液管是否够用，生物安全柜里面保证至少有一筒装有移液管的铁皮桶；酒精灯的酒精量是否够，若不够请及时添加工业酒精；移液枪是否有电，发现移液枪吸液速度慢了请及时充电；1000μl和200μl枪头是否够，保证生物安全柜里面有各有一盒；擦台面的棉球是否还有，若没有了请及时添加棉球（将医用脱脂棉撕成适宜大小的棉球）和75%酒精；各种型号EP管是否还有，没有了请及时灭菌放入生物安全柜内。
4. 灭菌消毒：开启紫外灯灭菌20-30分钟保证柜内空间无菌，如果紧接着其他实验使用生物安全柜，灭菌5-10分钟即可。
5. 灭菌完后，请打开风机，将挡板升高到一定高度，抽气5-10分钟，将臭氧全部排出。
6. 生物安全柜内所有操作必须带乳胶手套。
7. 实验完毕后，请适当处理废弃物，并且再次用酒精棉球擦拭台面。
8. 生物安全柜内只放一些必备用品，以免影响操作。
如果是私人实验所需物品，请在紫外灭菌之前将其放入进行灭菌。
紫外灭菌后，带入生物安全柜内操作的物品必须先经过灭菌处理。
为了方便他人实验，实验完毕后请务必将私人的实验用品取出。
二．细胞培养箱操作规程1. 培养箱每周换两次超纯水，每两月清洁培养箱一次。
清洁时用75%医用酒精擦拭培养箱，擦拭过程中应关闭培养箱。
2. 取放细胞的过程中严禁对着培养箱内说话，避免引入细菌；取放细胞的手套要喷过酒精，放进培养箱的培养瓶盖最好用75%医用酒精擦拭过。
3. 调节CO2钢瓶的压力为0.05–0.08 MPa，调节压力的时候应关闭培养箱，除仪器负责人不应随便调节CO2压力和仪器参数。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手；
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液；
2、将培养基如有需要还有血清和大瓶高糖培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取大培养皿6ml,
中培养皿3ml至一个新的15ml离心管中；一个1ml枪头
5、用适量PBS清洗细胞表面大皿5ml,中皿3ml,并弃去PBS；一个5ml枪头
6、加入适量胰酶消化细胞大皿1ml,中皿,此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；
C2C12用5min,3T3-L1用,一个1ml枪头
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管；一个5ml枪头
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基；
9、弃上清,口擦酒精,烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞沿壁轻轻吹打24次左右,按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱;一个1ml枪头
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清
洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常；
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。
操作规范
细胞转瓶传代一、目的：用于规范细胞传代，使细胞传代规范有序。
二、适用范围：适用于转瓶细胞穿代。
三、责任者：细胞穿代操作者。
四、正文1器材及试剂1.1器具：酒精灯止血钳酒精棉打火机消毒纱布培养转瓶瓶转瓶胶塞倒置显微镜转瓶机废液桶。
1.2 试剂：培养液（DMEM）0.25%胰酶消化液小牛血清等。
2 操作步骤2.1 取刚长成单层的BHK-21转瓶细胞，先用对转瓶表面消毒处理。
2.2 在局百下无菌操作下，打开转瓶胶塞，倒掉转瓶中的培养液。
2.3 先加入50ml胰酶消化液，均匀快速转动转瓶，让胰酶流遍所有细胞表面，洗一遍细胞，中和残余血清，倒掉胰酶消化液。
2.4 重新加入50ml胰酶消化液，均匀快速转动转瓶，让胰酶流遍所有细胞表面，开始消化细胞，边缓慢转动转瓶，边观察，当细胞间隙增大，瓶壁细胞现白雾状时，迅速倒掉胰酶，让残余的胰酶继续消化细胞。
2.5 当瓶壁出现细微划痕时，加入200ml 10血清的细胞生长液，快速让培养液流过所有细胞表面，终止消化。
2.6 盖上胶塞，快速摇动转瓶，利用培养液的剪切力将细胞摇散。
2.7 根据细胞密度及需要，确定扩传比例，在局百下打开转瓶胶塞，加入适量10%血清生长液，摇匀，将细胞分瓶，标记细胞种类，代次，传代时间。
2.8 分好的转瓶放入转瓶机中，转速设定为10r/h，37℃温室恒温培养。
3 清场和记录3.1 工作结束后应全面清场并填写工序记录表转瓶清洗一、目的：用于规范转瓶清洗，使转瓶清洗规范有序二、适用范围：适用于转瓶清洗三、责任者：转瓶清洗操作。
四、正文1、用过的转瓶应立即倒入洗衣粉，灌满自来水浸泡过夜，至少12h小时以上。
而接过毒的转瓶应先高压灭菌再浸泡2、用干净的毛刷刷洗转瓶瓶口残留的污渍，特别是瓶颈及瓶身对接处3、倒掉洗衣液，残留100ml用于刷洗。
刷洗时应注意均匀，避免留有死角，来回刷洗两遍，再用流水冲洗干净、晾干4、晾干的瓶子用重铬酸钾流酸洗液浸泡瓶底6h以上，再放到转瓶机上浸泡过夜，至少12h以上5、泡酸过后的转瓶自流水冲洗3min，注意瓶口及瓶身外面的冲洗。
MSC细胞传代培养标准操作流程(2)
间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。
2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。
3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。
3.2溶液配制记录。
3.3清场记录。
4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。
4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。
4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。
5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。
5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。
5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。
5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞培养传代标准操作规程.pdf
7、收拾所用物品、用 75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4.3.2 填写记录： 1、随试验进程做好试验记录 ( 按实验记录规范要求 ) ，包括试剂的厂家、批 号、效期 , 试验时间 , 试验结果。签字 2、填写仪器使用登记。 4.4 复核人复核
复核人复核、签字。 4.5 结果与判定 每天用显微镜观察细胞形态。
文件名称
Vero 细胞培养传代标准操作程序（ SOP）
文件编号 起草人 审核人
YY-33001-2016(01) 关威
批准人
页码 起草日期 审核日期 批准日期 执行日期 版本号
第
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2016 年 4 月 19
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01 分发号
细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规 范化。为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培 养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
酶消化效果最佳），每 1min 把培养瓶拿到倒置显微镜下观察， 当观察到细胞变圆， 透亮，细胞间隙明显增大时 ,加入先配好的完全培养基适量终止消化，用吸管轻 柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验，观察多 少密度的细胞具体几天可以长满 ,待有经验后此步骤可以省略。 ）
2、范围 ：适用于 Vero 细胞培养传代实验人员。 3、编制依据 《企业注册标准 WS4-(S-009-2)-2003Z》。 4、Vero 细胞培养传代操作规程 4.1 试药与试液 1、细胞： Vero 细胞 。 2、液体： 0.25%胰蛋白酶溶液； 7.5%碳酸氢钠溶液；小牛血清； PBS 缓冲 液； 10×199 培养液、灭菌注射用水、 EDTA 溶液。 4.2 仪器与用具 1、恒温培养箱； 2、倒置生物显微镜。 4.3 操作方法 4.3.1 细胞培养、传代 1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台 30min。 2、挑选细胞形态佳、无污染的 Vero 细胞，弃旧生长液。 3、细胞面经少量 EDTA 溶液洗涤后，加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺 平培养瓶底为佳） ，倒置显微镜下观察培养瓶内细胞，一旦发现大量细胞胞质回 缩，细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去， 4、把细胞培养瓶置 37.0℃± 0.5℃孵育让残存的胰酶继续消化， （在 37℃胰
细胞传代流程
细胞传代流程细胞传代呀，就像是一场细胞的接力赛！你得把细胞们好好地传递下去，让它们继续茁壮成长。
先说说细胞培养瓶吧，这就像是细胞的小家。
当细胞在这个小家里住得满满当当的时候，就该给它们换个更大的地方啦，不然它们会觉得很拥挤呢。
准备工作可得做好咯！要把需要的东西都准备齐全，什么胰蛋白酶呀，培养基呀，离心管呀，一个都不能少。
就好像你要出门旅行，得把行李都收拾好一样。
然后呢，把培养瓶从培养箱里小心翼翼地拿出来，可别把细胞们吓着啦！轻轻摇晃一下培养瓶，让细胞们松动松动，就像是叫醒睡梦中的小宝贝们。
接着，加入适量的胰蛋白酶，让细胞们和胰蛋白酶亲密接触一会儿，这是为了让细胞从瓶底上脱离下来。
等一会儿，你就会看到细胞们开始慢慢地飘起来啦，就像雪花在空中飞舞一样。
这时候，赶紧把含有细胞的胰蛋白酶吸出来，放进离心管里。
离心管就像是细胞们坐的小电梯，带着它们去到一个新的地方。
把离心管放进离心机里，让它们快速地转一转，把细胞和胰蛋白酶分离开来。
离心结束后，把上清液倒掉，可别把细胞也倒掉啦！然后加入新鲜的培养基，就像给细胞们送上美味的食物和饮料。
用吸管轻轻地吹打细胞，让它们均匀地分布在培养基里，这就像是给细胞们搅拌食物，让它们吃得更开心。
接下来，就可以把细胞们分到新的培养瓶里啦！每个培养瓶里都装上适量的细胞和培养基，就像给每个小家庭分配好房间和生活用品。
把培养瓶放回培养箱里，让细胞们继续快乐地生活和生长。
哎呀，细胞传代可不简单呢，但只要你细心、耐心，就一定能做好！你想想，通过你的努力，让这些小小的细胞不断地繁衍下去，是不是很有成就感呀？就像看着自己种的小树苗慢慢长大一样开心呢！而且，细胞传代对于科学研究和医学治疗都有着非常重要的作用呢。
所以呀，可别小瞧了这个过程哦！总之呢，细胞传代就是这么一个有趣又重要的事情，需要我们认真对待，好好呵护这些小生命，让它们为我们的科学事业和健康事业做出贡献！。
细胞传代
细胞传代：1．试验准备流程：洗器材——烘干——泡酸——烘干——包装——高压——烘干——放入细胞室的柜子或超净台——准备试验的其他用品（试剂、器材）——用75%酒精擦拭物品及超净台台面——放入超净台并用紫外线照射，开风机——30分钟后开始试验——试验过程——试验结束并打扫超净台2．试验材料培养的细胞，如Hela细胞3．试验试剂及器材：试剂：1640培养基注：可直接从试剂公司买配制好的溶液，也可买粉状制剂自己回来配胎牛血清FBS 注：有时也可用小牛血清双抗注：双抗为青霉素和链霉素PBS溶液胰酶注：这是“胰蛋白酶”的简称器材：高压过的吸管和细胞培养瓶，酒精棉球，记号笔——第一列器材酒精灯，打火机，洗耳球，封口膜——第二列器材废液缸1号，带有75%酒精和纱布的废液缸2号第三列器材4．试验步骤：⑴．从准备室取2号废液缸，带入细胞室。
⑵．按照细胞室的规定进入细胞室。
⑶．用2号废液缸中的酒精擦拭超净台台面。
⑷．把4℃冰箱中的试剂，柜子中的第一列器材分别取出，用2号废液缸中的酒精分别擦拭这些物品，并放入超净台内。
⑸最后擦拭1号废液缸（里外都擦），并放入超净台内。
打开紫外灯和风机，照射至少30分钟，此时试验人员可以暂时离开。
⑹半小时后按照细胞室规定进入细胞室。
⑺开始试验。
⑻．打开酒精灯，将酒精灯放在操作区的正前方。
灯盖要远离试验操作区。
⑼．用酒精棉球认真擦手一遍，若觉消毒不够彻底，还可再消毒一遍。
⑽．烧吸管：将吸管桶拿起，酒精灯烧开口处；右手打开吸管桶，左手用腕力将吸管振出，只可振出一根吸管，用右手的中指和无名指夹出吸管，不可碰到其他的吸管及桶口。
酒精灯烧桶口和桶盖，孔与孔不重叠的盖上。
取出的吸管粗端烧过后用同样也烧过的洗耳球装好，然后从此端开始烧吸管，一直到尖端，并把尖端多烧一会。
然后放在试管架上。
以此种方法按照需要量烧相应数目的吸管。
本试验需4根。
⑾．取细胞：烧好吸管后，打开培养箱，取出培养瓶，同时在培养箱中拧紧瓶盖，放在显微镜下观察，观察细胞的生长状况，判断该怎么处理细胞。
细胞传代培养标准操作规程
细胞传代培养（消化法）标准操作规程一、原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂1. 无菌磷酸生理缓冲液（PBS）2。
胰酶-EDTA溶液(0。
05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na）: 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基4。
无菌吸管/离心管/培养瓶三、操作步骤1。
传代前准备(1）预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶.（6）取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
(8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒.2。
胰蛋白酶消化（1）加入消化液：小心吸出旧培养液,用PBS清洗（冲洗）,加入适量消化液（胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3)吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液.3. 吹打分散细胞(1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2)吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中.（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6—8分钟。
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细胞传代培养SOP（消化法）
具体步骤如下：
1. 传代前准备：
1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。
1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。
1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶-EDTA消化：
2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T <
2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞：
3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。
3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞：
4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。
最后要做好标记。
5. 继续培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。
传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时
为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
传代细胞培养注意事项：
1. 严格的无菌操作
2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
加入培养瓶中的量等一旦胞质回缩，连。