高效液相色谱操作手册
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HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项:
1使用前,应申明样品名称和特性以及使用的流动相。
2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。
3溶剂必须经微孔滤膜过滤,所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。
4不得在计算机上进行与实验无关的操作。
5注意适时更换废液收集瓶,防止废液溢出。
6认真登记实验记录。
7相关论文发表后,应送一份复印件给中级仪器实验室。
北京大学化学学院中级仪器实验室
一、概述
HPLC1100系统构成如下:
1 流动相A B C D
2 真空脱气装置3、6、9、11 电缆
4 输液泵
5 自动进样器(无)7 柱温箱8 检测器(DAD)
10 数据接收处理控制系统(计算机)12 打印机13 手动进样器
1.指示灯状态
每个部件接通电源后,LED灯显示绿色;
黄色Not Ready
绿色Run
红色Error
2.四元泵系统的工作原理图
3.柱温箱的特征
●可以在低于室温10℃至80℃间恒温
●空间大,可以容纳三根30cm长的柱子
●安装柱识别可以记录进样次数
●两个单独的加热区
●可以程序升温
4.检测器
HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示:
光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后,照射到流通池上,透射光经全息凹面衍射光栅色散后,投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件,它有三个动作位置:(1)光闸将入射光束全部遮挡,以进行暗电流补偿;(2)将氧化钬滤光片插入光路,对衍射后的波长进行精确校正;(3)打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。
HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成,熟悉软件十分重要。本系统操作是基于Windows NT的多窗口多任务操作系统,要注意窗口之间可能覆盖。
根据所选色谱柱的性能,本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱(可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析)。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口,大连化物所及天津Autoscience公司可提供,一般分析柱的价格在1600-2000元之间,HP进口柱价格在4000元人民币左右。
本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗,但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。
二、开机
打开各部分电源,脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。
开启计算机,若有选项,选择开启Windows NT4.0。点START-PROGRAM-HPChemStation-Instl online,计算机开始与仪器联接,并打开各控制界面,此时,各单元指示灯变绿,在工具条的View中选择界面为Runcontrol。
在第一个小窗口中利用下拉菜单,选择显示界面为Method and Run Control;
在第二个小窗口中选择已设定的使用方法(若是旧用户则有记录),新用户先编辑实验方法,然后选工具栏中Method-Save Method As(具体见后)。
第三个小窗口中显示LC操作条件。
三、样品分析
1.溶剂的处理和设置
不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器,降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能,延长溶剂过滤器的寿命:
●使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌
●用滤膜过滤溶剂去除微生物
●每二天更换或过滤溶剂
●避免溶剂瓶直接日照
各洗脱液应分别过滤,注意有机相和水相应使用不同的滤膜。
避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂:
●卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂
●高浓度的无机酸例如:硝酸和硫酸
●能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物
●含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物
●在有机溶剂中的有机酸溶剂
●含有强络合剂的溶液
●四氯化碳和异丙醇或THF混合物
溶剂的设置:
在输液泵图标上按鼠标左键,在出现的小菜单中选Setup Pump,在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称;点溶剂瓶图标,在Solvent Bottles Filling中输入A、B、
C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。
2.设置泵的参数
点输液泵图标,选Setup Pump,出现流速控制界面。设定流速flow rate(一般ODS
柱为1ml/min);设定A、B、C、D各溶剂比例,其中B、C、D可设置。OK。
点输液泵图标,选pump control,点ON打开泵,OK,泵即开始工作,图标亦变为绿色。泵压一般不要超过150bar。
若要设置各种淋洗变换程序如梯度洗脱,点输液泵图标,在此界面下面的空栏中,用Append添加一栏,依次输入时间、浓度、流速。可用Cut删去某一行或多行。设定好后,点OK退出本界面。
其压力及时间程序过程在图标上的指示框里显示,
3.设定柱温
在柱子图标上按鼠标左键,选Setup Column Thermostat设置柱温,可在室温以下10度至80度稳定控制,精度达到0.1度。设定后点OK退出,再点此图标,选Control 打开恒温器。但若设定温度后直接点OK,则出现一英文对话框,询问是否打开温控,按yes钮即可。一般温度设置在30-50度之间。若不需控温,则在Setup Column Thermostat窗口中选not control。
4.检测器参数设定
注意:为了延长氘灯和钨灯的使用寿命,在开始分析前进行预平衡时(每次分析前最好用待用流动相平衡20个柱体积以上)或所有分析完成后淋洗色谱柱时,不需打开检测器,仅在分析样品前10分钟左右打开即可。因此,在检测器的control窗口中,一定不要选择At power on , turn UV/VIS lamp on。
在检测器图标中按鼠标左键,选Setup DAD Signals,出现检测器参数设定窗口,在此设定存储及检测信号:
每一谱图可选5个通道(A、B、C、D、E)检测。若需某个波长的信号,则在任一通道的小方框中打上X,然后设定检测波长及参比波长。其它参数如波长范围、时间、灯开关等,基本都不用变化,若需变化请与工作人员联系。完成后点OK退出。注:一般情况下可将参比波长OFF,(点▼即可)。为减少噪音,可选择待分析化合物吸收为零处的某一段波长为参比波长。
若想鉴定某化合物纯度,若其吸收光谱为,可选检测在λ2,参比在λ1,因为ξλ2/ξλ1一定,若为纯化合物,所测色谱峰为形。为便于观察,可再在检测器图标下选择On-Spectra,可观察到检测器中的紫外可见吸收光谱图。
常用溶剂的紫外吸收
Solvent UV Cutoff(nm)
Acetonitrile 190
Water 190
Cyclohexane 195
Hexane 200
Methanol 210
Ethanol 210
Diethyl Ether 220
Dichloromethane 220
Chloroform 240
Carbon Tetrachloride 265
Tetrahydrofuran 280(210)
Toluene 210