高效液相色谱操作手册

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HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项:

1使用前,应申明样品名称和特性以及使用的流动相。

2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。

3溶剂必须经微孔滤膜过滤,所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。

4不得在计算机上进行与实验无关的操作。

5注意适时更换废液收集瓶,防止废液溢出。

6认真登记实验记录。

7相关论文发表后,应送一份复印件给中级仪器实验室。

北京大学化学学院中级仪器实验室

一、概述

HPLC1100系统构成如下:

1 流动相A B C D

2 真空脱气装置3、6、9、11 电缆

4 输液泵

5 自动进样器(无)7 柱温箱8 检测器(DAD)

10 数据接收处理控制系统(计算机)12 打印机13 手动进样器

1.指示灯状态

每个部件接通电源后,LED灯显示绿色;

黄色Not Ready

绿色Run

红色Error

2.四元泵系统的工作原理图

3.柱温箱的特征

●可以在低于室温10℃至80℃间恒温

●空间大,可以容纳三根30cm长的柱子

●安装柱识别可以记录进样次数

●两个单独的加热区

●可以程序升温

4.检测器

HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示:

光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后,照射到流通池上,透射光经全息凹面衍射光栅色散后,投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件,它有三个动作位置:(1)光闸将入射光束全部遮挡,以进行暗电流补偿;(2)将氧化钬滤光片插入光路,对衍射后的波长进行精确校正;(3)打开光闸使入射光通过样品流通池照在光栅上。

HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成,熟悉软件十分重要。本系统操作是基于Windows NT的多窗口多任务操作系统,要注意窗口之间可能覆盖。

根据所选色谱柱的性能,本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱(可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析)。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口,大连化物所及天津Autoscience公司可提供,一般分析柱的价格在1600-2000元之间,HP进口柱价格在4000元人民币左右。

本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗,但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。

二、开机

打开各部分电源,脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。

开启计算机,若有选项,选择开启Windows NT4.0。点START-PROGRAM-HPChemStation-Instl online,计算机开始与仪器联接,并打开各控制界面,此时,各单元指示灯变绿,在工具条的View中选择界面为Runcontrol。

在第一个小窗口中利用下拉菜单,选择显示界面为Method and Run Control;

在第二个小窗口中选择已设定的使用方法(若是旧用户则有记录),新用户先编辑实验方法,然后选工具栏中Method-Save Method As(具体见后)。

第三个小窗口中显示LC操作条件。

三、样品分析

1.溶剂的处理和设置

不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器,降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能,延长溶剂过滤器的寿命:

●使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌

●用滤膜过滤溶剂去除微生物

●每二天更换或过滤溶剂

●避免溶剂瓶直接日照

各洗脱液应分别过滤,注意有机相和水相应使用不同的滤膜。

避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂:

●卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂

●高浓度的无机酸例如:硝酸和硫酸

●能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物

●含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物

●在有机溶剂中的有机酸溶剂

●含有强络合剂的溶液

●四氯化碳和异丙醇或THF混合物

溶剂的设置:

在输液泵图标上按鼠标左键,在出现的小菜单中选Setup Pump,在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称;点溶剂瓶图标,在Solvent Bottles Filling中输入A、B、

C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。

2.设置泵的参数

点输液泵图标,选Setup Pump,出现流速控制界面。设定流速flow rate(一般ODS

柱为1ml/min);设定A、B、C、D各溶剂比例,其中B、C、D可设置。OK。

点输液泵图标,选pump control,点ON打开泵,OK,泵即开始工作,图标亦变为绿色。泵压一般不要超过150bar。

若要设置各种淋洗变换程序如梯度洗脱,点输液泵图标,在此界面下面的空栏中,用Append添加一栏,依次输入时间、浓度、流速。可用Cut删去某一行或多行。设定好后,点OK退出本界面。

其压力及时间程序过程在图标上的指示框里显示,

3.设定柱温

在柱子图标上按鼠标左键,选Setup Column Thermostat设置柱温,可在室温以下10度至80度稳定控制,精度达到0.1度。设定后点OK退出,再点此图标,选Control 打开恒温器。但若设定温度后直接点OK,则出现一英文对话框,询问是否打开温控,按yes钮即可。一般温度设置在30-50度之间。若不需控温,则在Setup Column Thermostat窗口中选not control。

4.检测器参数设定

注意:为了延长氘灯和钨灯的使用寿命,在开始分析前进行预平衡时(每次分析前最好用待用流动相平衡20个柱体积以上)或所有分析完成后淋洗色谱柱时,不需打开检测器,仅在分析样品前10分钟左右打开即可。因此,在检测器的control窗口中,一定不要选择At power on , turn UV/VIS lamp on。

在检测器图标中按鼠标左键,选Setup DAD Signals,出现检测器参数设定窗口,在此设定存储及检测信号:

每一谱图可选5个通道(A、B、C、D、E)检测。若需某个波长的信号,则在任一通道的小方框中打上X,然后设定检测波长及参比波长。其它参数如波长范围、时间、灯开关等,基本都不用变化,若需变化请与工作人员联系。完成后点OK退出。注:一般情况下可将参比波长OFF,(点▼即可)。为减少噪音,可选择待分析化合物吸收为零处的某一段波长为参比波长。

若想鉴定某化合物纯度,若其吸收光谱为,可选检测在λ2,参比在λ1,因为ξλ2/ξλ1一定,若为纯化合物,所测色谱峰为形。为便于观察,可再在检测器图标下选择On-Spectra,可观察到检测器中的紫外可见吸收光谱图。

常用溶剂的紫外吸收

Solvent UV Cutoff(nm)

Acetonitrile 190

Water 190

Cyclohexane 195

Hexane 200

Methanol 210

Ethanol 210

Diethyl Ether 220

Dichloromethane 220

Chloroform 240

Carbon Tetrachloride 265

Tetrahydrofuran 280(210)

Toluene 210

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