实验二-经口急性毒性试验-Acute-Oral-Toxicity
经口急性毒性试验
经口急性毒性试验※<(一)目的>化学毒物经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。
奉实习的目的是学习急性毒性试验的实验设计原则，学会经口灌胃技术、随机分组方法，掌握主要的LD50计算方法和急性毒性分级标准。
※<(二)原理>选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。
一次或24h内多次给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
※<(三)内容>1．健康小鼠或大鼠的选择，性别的辨认。
2．称重、编号和随机分组方法。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠和大鼠经口灌胃操作技术．5．毒性体征的观察、LD50计算和毒性分级※<(四)材料和试剂>1.实验动物健康成年小鼠或大鼠若干只。
2.器材灌胃针(大鼠、小鼠适用)、注射器(0.25，1.2，5m1)、吸管(0. 1，0.2，0.5，1，2，10ml)、容量瓶(10，25，50ml)、烧杯(10，25，50ml)、滴管、电子天平(感应量1／10000g)、动物体重秤、外科剪刀、镊子。
3.试剂受试物(由指导教师自定)，苦味醒酒精饱和液，o．5％品红溶液或其他染色剂．※<(五)操作步骤>1．健康动物的选择。
2．性别辨认。
3.动物称重、编号和分组；(1)称重；称量大、小鼠体重的秤，其感应量需在0.1g以下，并经过校正。
称量时注意轻抓轻放动物，避免激惹，等动物安静后记录体重读数，以g表示。
(2)编号：以染色法编号。
用苦味醒酒精饱和液为染料。
以黄色为个位数号码，红色为十位数号码。
一股以头部为1号，按顺时针依次右前肢为2号，右腰为2号，右后肢为4号，尾根部为5号，右后肢为s号，左腰为7号，左前肢为8号，后背为9号，10号为在头部染红色标记，11号在右前肢染红色和黄色标记各一，依次类推。
急性经口毒性试验
二、急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本规范规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 401, Feb. 1987 )USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1100, Aug. 1998 )3 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量的依据。
4 定义4.1 急性经口毒性(Acute oral toxicity)：一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口LD50（半数致死量，Medium lethal dose）：经口一次给予受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表示。
5 试验的基本原则以管饲法经口给予各试验组动物不同剂量的受试物，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试物受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中，建议首选水，其次是植物油(如玉米油)，或考虑使用其它介质（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。
对非水溶性介质，应了解其毒理特性，否则应在试验前先确定其毒性。
每次经口染毒液体的最大容量取决于实验动物的大小，对啮齿类动物所给液体容量一般为1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。
通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。
经口急性毒性试验.
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整
急性经口毒性试验 上下增减剂量法
附件12急性经口毒性试验上下增减剂量法Acute Oral Toxicity Test Up-and Down Procedure1 范围本方法规定了急性经口毒性试验上下增减剂量法（上下法）的基本原则、要求和方法。
本方法适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他毒理学试验剂量的依据。
3 定义3.1 急性经口毒性acute oral toxicity一次或在24 h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。
3.2 经口半数致死量（LD50）oral medium lethal dose经口一次给予受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表示。
3.3 延迟死亡delayed death设定的给药间隔（通常为48 h）内不引起受试动物死亡或出现濒死状态，但在14 d的观察期间内出现死亡。
3.4 剂量级数因子dose progression factor也称为剂量步进因子。
是指主试验中，当前剂量的一只动物存活或死亡时，下一只动物染毒剂量增加或降低倍数。
剂量级数因子建议为1/（估计的剂量-反应曲线斜率）的反对数。
默认的剂量级数因子为3.2，即0.5（1/2）的反对数。
3.5 限值剂量limit dose受试动物进行急性经口毒性试验的上限剂量（2000 mg/kg或5000 mg/kg）。
3.6 逆转reversal是指在某个染毒剂量下观察动物无反应，在下一个染毒剂量下观察动物有反应的现象，反之亦然（也就是前一个动物发生反应，后一个动物无反应）。
因此，一对不同的动物染毒反应情况产生一个逆转。
3.7 名义受试动物量nominal sample size是指受试动物的总数量按下列规则减去一定量动物数：（1）减去染毒序列开始时出现相同反应的最后1只动物之前的受试动物数量，（2）或减去第一次发生逆转的一对动物之前受试动物的数量。
经口急性毒性试验
经口急性毒性试验经口急性毒性试验是一种广泛使用的实验室动物毒性试验，它通常用于评价新化合物、生物制品等物质的毒性，以及评估安全使用剂量的潜在结果。
这篇文章将介绍经口急性毒性试验的背景、方法、注意事项和限制。
背景方法经口急性毒性试验通常使用小鼠、大鼠、兔子或其他哺乳动物，动物必须年龄相似、体重相当且健康状态良好。
实验中使用不同剂量的测试物质来确定它们在动物体内的毒性。
通常，实验中使用的剂量量较低，但有时也会使用较高的剂量以便观察更加严重的毒性反应。
其实验流程如下：1.选取合适且健康的实验动物，检查其体内和体外健康状况；2.确定实验剂量，并将物质以食物、水、灌胃管等方式交予动物口服；3.观察动物的外观、行为和症状，记录观察结果；4.在一定时间后继续观察动物，在必要时应用适当的护理；5.按照实验协议的规则处理动物，以确保其安全。
注意事项在进行经口急性毒性试验时，需要注意以下几点：1.确定剂量：需要选择适当的实验剂量，以确保所测试的物质不会对动物造成过度毒性反应，且可以解释毒性的分级。
2.采取恰当的动物保护措施：对于实验过程可能造成疼痛或不适的情况，应采取适当的保护措施，例如提供充足的饮水、合适的饲料和温度环境。
3.保证实验数据质量：为了确保实验数据质量，需要在实验过程中跟踪记录、分析数据，并确定实验的有效性以及物质毒性分级的准确性。
限制虽然经口急性毒性试验是一种有效的毒性评估方法，但它有一定的局限性。
经口急性毒性试验只能评估物质对动物的急性毒性反应，而对于慢性毒性、免疫毒性或生殖毒性等长期影响，它并不能提供完整的信息。
此外，每种动物特征不同，对物质的敏感程度也会不同，因此难以将实验结果适用于不同品种的动物和不同的物质评估。
因此，除经口急性毒性试验外，还需要完善其他的毒性评估方法以更准确地评估药物、化学物质和其他物质的毒性。
急性经口毒性实验方法的比较与选择
急性经口毒性实验方法的比较与选择国内外的农药管理机构在对农药进行安全评价时，农药的急性毒性实验是必不可少的。
通过研究实验哺乳动物在不同接触途径（口腔、皮肤、呼吸道、眼睛）下对农药的中毒反应，来推测该农药对人类、家畜等的毒性大小，从而为安全生产、储存、运输及使用农药制定指导性文件。
急性经口毒性的概念急性经口毒性（acute oral toxicity）：机体一次或24h内多次经口接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
急性经口毒性试验的目的1）求出致死剂量及其他急性毒性参数2）观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征3）为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据4）为毒理学机制研究提供线索急性经口毒性的参数半数致死剂量：LD50实验要点(一)健康实验动物的选择和性别鉴定。
(二)实验动物称重、编号和随机分组方法。
(三)受试化合物溶液的配制。
(四)小鼠灌胃技术。
(五)毒性症状的观察和LD50计算。
国际通用的几种急性经口毒性实验方法传统的急性经口毒性试验多采用霍恩氏法和改良寇氏法。
我国过去普遍采用的急性毒性的评价方法大体上可以归为两类：一是死亡率剂量反应要求为正态分布的，其中概率分配图解法和寇氏法（Karber）较为常用；另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），查对有关表格即可得到LD50值，如霍恩氏法（Horns）等。
目前中国主要采用三种急性经口毒性试验方法，分别为霍恩氏法、序贯法（up-and-down procedure）、概率单位法（Miller and Taninter’s method）。
具体方法可参看中华人民共和国国家标准GB/T 15670-2017 （农药登记毒理学试验方法）第2、3、4部分内容。
美国EPA农药登记推荐的方法是OPPTS 870.1100，实际内容与OECD 425 （up-and-down procedure）一致。
(整理)经口毒性实验
急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。
本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。
2 规范性引用文件OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 ) OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 ) USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)3 试验目的3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度。
3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。
3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。
４定义4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。
4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。
5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。
实验二 经口急性毒性实验
实验二经口急性毒性实验一、实验目的1、通过本次实验掌握经口灌胃技术，半数致死剂量的意义。
2、通过本次实验学习半数致死剂量的计算及毒性判定。
二、实验原理：化学物经口染毒的方法是毒理学中重要的基本技术之一，经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。
通过该实验学习化学物毒性试验的实验设计原则和掌握经口灌胃技术。
三、仪器、试剂与材料1、器材帆布手套、橡胶手套、电子天平、剪刀、大头针、小鼠鼠笼、泡沫塑料板、棉签、纱布、脱脂棉、小鼠灌胃针、1ml注射器、电子天平、动物体重秤等2、试剂敌百虫、苦味酸饱和溶液。
3、实验动物成年、健康的雌、雄小鼠50只。
四、实验内容与步骤1、实验动物的性别鉴定、编号、称重和分组参考实验一中动物性别鉴定、编号和分组方法，50只小鼠，雌雄各半，随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、五组，各小鼠用电子天平称重，以g为单位，小数点后保留一位数字。
2、确定染毒剂量：经预试验获得敌百虫0％～100％的致死剂量范围，由公式计算各组剂量公比值r：1/-r，根据公比值确定各组正式剂=n ab量。
a：最低组剂量，mg/kgb：最高组剂量，mg/kg3、配制毒物溶液准确称取敌百虫2024mg，溶解并稀释至10 mL，取5 mL置于容器中，供第五组染毒；加入5 mL溶剂，稀释后取出5 mL供第四组动物染毒；再加入5 mL溶剂，稀释后取出5 mL供第三组动物染毒用，依此类推，可配制成按1:0.5递减的各剂量组不同浓度的溶液。
4、计算每只动物实际灌胃体积每只小鼠实际灌胃量＝0.02 mL/g ×该小鼠体重g5、染毒（1）动物的禁食和复食：试验前，实验动物禁食过夜，不限制饮水，灌胃后2-3h后复食（2）灌胃操作技术：同实验一小鼠灌胃染毒法。
6、中毒体征和死亡情况观察染毒后观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡数量和时间及死亡前的特征。
高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应即刻密切观察。
根据观察情况分析中毒特点和毒作用靶器官。
急性经口毒性实验
（2）植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪； （3）呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、血性分泌物、呼吸
深缓、呼吸过速、仰头呼吸、； （4）泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房
2020/4/24
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（二）剂量选择：
首先查阅与受试化学物结构及理化性质相近似 的化学物的LD50，以此值作为受试化学物的预期 毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1-2 个
剂量组，进行预实验。
各剂量组的间距可根据LD50 计算方法要求按等 比级数或等差级数安排。
本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数 排列，常用1：0.8，如敌敌畏的最高剂量为125 mg/kg，其次剂量组为125 mg/kg *0.8=100 mg/kg ，依次类推为80 、64 和51.2 mg/kg五 个剂量组。
各剂量组小鼠灌胃容量计算:
小鼠灌胃容量V ml=体重（g）×10ml/1000g
各剂量组小鼠染毒剂量:
小鼠染毒剂量= V ml ×各组的受试物浓度（mg/10ml)
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（四）灌胃方法：
小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠头部两耳后 皮肤，无名指或小指将尾部紧压在手上，使小鼠腹 部向上，尽量使其体位垂直，注意使动物的上消化 道固定成一直线。右手持连着灌胃导针的注射器， 将灌胃针由动物口腔侧插入，避牙齿，沿咽后壁缓 缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一 旦感觉阻力消失，即深人至胃部，一般进针深度小 鼠2.5～4cm，随后将受试物溶液注入。如遇动物挣 扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入， 以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。
实验二-经口急性毒性试验
毒理学实验二经口急性毒性试验一、实验目的1、掌握实验动物分组方法2、测定LD50的试验设计原则3、小鼠的经口灌胃技术二、试剂和材料1、实验动物：（1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g（2）样品来源：首都医科大学实验动物部2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。
3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。
三、实验内容1、健康实验动物的选择和性别鉴定选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。
动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。
）肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性2、实验动物称重、编号和随机分组选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。
3、受试化学物溶液的配制（1）确定灌胃量：0.1ml/10g（2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积（3）药品称量及稀释4、小鼠灌胃技术左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。
5、毒性体征的观察和LD50计算（1）毒性体征的观察：染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min组数：各组死亡率：数相邻两组对数剂量之差：最大剂量的对数 P d :X )P P (d 21X lg 150i i k i i k LD ∑++-=)lg 96.1(lg lg 95%:1)P 1(P d lg 50501-50LD S LD ni ni LD S i i ±--=∑可信区间：实验动物数。
标准误公式：（2）LD50的计算：a 、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。
剂量组距 d 为：d 为相邻两个剂量组剂量对数之差利用lgLD0依次加d ，取反对数，即可得出各组剂量。
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
【推荐】第二次--经口急性毒性实验
二 、实验原理
选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原则将动物分成数 个染毒组。给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征 以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量（LD50），并 根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。本次实验采用改进寇氏法。 改进寇氏法: 利用剂量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法。要求如下: 每个染毒剂量组动物数相同， 各剂量组组距呈等比级数， 死亡率呈正态分布， 最低剂量组死亡率<20％， 最高剂量组死亡率>80%。
治疗提供参考。
实习报告要求
• 一、目的意义 • 二、实验原理 • 三、实验材料（实验动物, 受试物）及仪器 • 四、实验步骤(随机分组, 试剂配制） • 五、实验结果（包括两个表、计算结果） • 六、结果评价
• 1、说明受试物的基本情况（名称、纯度、状态等）和配 制方法；
• 2、实验动物的种属、级别。实验前动物禁食情况和健康 状况；
雄A= V * K / (K-1)
•
＝5*1.28/ ( 1.28－1)
=5*1.26/(1.26-1)
•
＝22.9ml
=24.2ml
• 4.下一组溶液的配置： 等比稀释法 A*（1/K）
• 雌性=A×（1/k）=22.9 ×(1/1.28)=17.9ml
• 雄性=A×（1/k）=24.2 ×(1/1.26)=19.2ml
受试物名称: 敌敌畏 验室
受试物性状: 乳油 受试物来源: 毒理实
动物种属品系: 小鼠，昆明种 物中心
毒理学 实验二、急性经口毒性试验
LD50测定方法 霍恩（Horn)法（剂量递增法） ——查表 改进寇氏法(karber’s method) 几率单位法
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改进寇氏法(karber’s method) 基本要求：
每个染毒剂量组的实验动物数量相同； 各剂量组组距呈等比级数； 死亡率呈正态分布； 最低剂量组死亡率<20%，最高剂量组死亡率>80%。
实验二、经口急性毒性试验
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急性毒性的概念
急性毒性（acute toxicity）是指实验动物一次或 24h内多次接触一定剂量外源化学物后在短期内所产生的健 康损害作用及致死效应。
观察指标包括一般行为和外观改变、大体形态变化 以及死亡效应。
2
（二）急性毒性试验的目的
1.求出致死剂量及其他急性毒性参数，并根据 LD50对急性毒性进行分级。 2.观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步 评价毒物的毒效应特征。 3.为后续的毒性试验提供接触剂量和观察指标选 择的依据。 4.为毒理学机制研究提供线索。
i——相邻两剂量组之对数剂量差值； Xk——最大剂量的对数值； p——死亡率； q——存活率（q = 1－p）； ∑p——各剂量组死亡率总和； m —— lgLD50； n——每组动物数。
最后求反对 数得LD50及 可信区间
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表6-3 我国农药的急性毒性分级
级别
经口LD50
经皮LD50
吸入LC50
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表1. 急性毒性实验原始记录
受试物名称： 动物物种品系： 染毒途径：
受试物性状： 动物来源： 室温：
受试物来源：
组别 剂量 动物 性 体重 染毒量 染毒 体征及 死亡 体重 (mg/kg) 编号 别 (g) (ml) 时间 出现时间 时间 记录(g)
毒理学评价的四个阶段和内容
毒理学评价的四个阶段和内容通常包括以下：
1. 急性毒性试验（Acute Toxicity Testing）：
这是毒理学评价的第一阶段，主要目的是确定物质在短时间内（通常是一次或几次接触后）对生物体产生的有害效应。
内容包括：经口、皮肤接触和吸入途径的急性毒性试验，计算LD50（半数致死剂量），即导致一半实验动物死亡的剂量。
2. 遗传毒性试验（Genotoxicity Testing）：
这个阶段评估物质是否能够引起遗传物质（DNA）的损伤，这可能导致突变、癌症或其他遗传疾病。
内容包括：Ames试验（细菌回复突变试验）、染色体畸变试验和微核试验等。
3. 亚慢性毒性试验（Subchronic T oxicity Testing）：
在这个阶段，物质的毒性效应在较长时间内（几周到几个月）被研究。
内容包括：重复剂量毒性试验，观察动物的行为变化、体重变化、血液学参数、生化指标、器官重量和病理学改变等。
4. 慢性毒性试验和致癌性试验（Chronic T oxicity and Carcinogenicity Testing）：
这是最长的一个试验阶段，通常持续数月到数年，旨在评估物质长期暴露对生物体的影响，包括潜在的致癌性。
内容包括：生命周期研究，观察生长发育、生殖能力、寿命以及肿瘤发生率等。
在这些试验中，除了直接的毒性效应外，还会考虑物质的代谢途径、蓄积效
应、剂量-反应关系以及敏感群体（如孕妇、儿童和老人）的特殊反应。
这些信息对于全面评估物质的安全性和风险管理至关重要。
值得注意的是，具体的试验设计和要求可能会根据监管机构的指导原则和物质的特性进行调整。
经口毒性实验
急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、技术和要求。
本方法适用于评价化学品的急性毒性作用。
2 规范性引用文件OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 401. Feb. 1987 ) OECD Guideline for Testing of Chemicals (No. 425. Feb. 2001 ) USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series 870.1100 June 1996)3 试验目的3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度。
3.2 为亚急(慢)性等毒性试验提供剂量选择的依据。
3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识。
４定义4.1 急性经口毒性(Acute Oral Toxicity): 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试样品后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口半数致死剂量（Oral Median Lethal Dose）: 经口一次或24h内多次经口给予受试样品后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试样品的质量(mg/kg bw或g/kg bw)来表示。
4.3 剂量-反应关系(Dose-response Relationship)：表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。
5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中，（不溶性固体或颗粒状物质研磨、过100目筛）建议首选水或食用植物油（如玉米油）作溶剂，也可考虑使用其它赋形剂（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）等配成混悬液；不能配制成混悬液时，可配制成其它形式(如糊状物等)，但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。
经口急性毒性试验
2
试剂和ห้องสมุดไป่ตู้料
1.受试动物 健康小鼠50只 2.器材 玻璃匀浆器、注射器、容量瓶、烧杯、灌胃器、电子天平（感量 0.1g） 3.试剂 氯硝柳胺悬浮液
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4
方法
（一）健康动物的选择和性别鉴定（见实验一） 急性毒性试验选择动物的体重要求：小鼠18-22g，大鼠180-200g。 （二）动物称重、编号与随机分组（见实验一） （三）剂量分组 经预试求出受试化学物的大致致死范围（0-100%），按等比级数设计5-7个 剂量组。
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六．LD50计算方法 １、平均致死量法（又名寇氏法） 此法计算LD50较为简便，但实验要符合下列要求： （１）每个实验组动物数要相同； （２）各组剂量要按等比级数分组； （３）最大剂量的死亡率最好为100%或与之接近，最小剂量的死亡率最好为0%或与 之接近，计算公式如下： LD50=Log-1[Xm-i(Σp-0.5)]式中: xm——最大剂量的对数值 i——组距，即相邻两组剂量对数剂量之差 p——各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示）
2 0 1 5
动物毒理学实验
实验二 经口急性毒性试验
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1
目的和原理
急性毒性试验的目的是推测新药对人的急性毒性的强弱。同时，它可以为长期 毒性试验、生殖毒性试验、致突变试验等试验设计提供剂量选择依据和有关毒 性信息，还可以推测受试药物毒性发生的速度和持续时间，与半数有效量(ED50) 比较判断新药的安全系数。因此，急性毒性试验对了解新药的毒性是非常必要 的。 急性毒性试验的原理是动物一次或24h内多次接触外源化学物后，观察急性毒性 反应及其程度，中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量-反应关 系，求出LD50。
急性经口毒性试验 Acute Oral Toxicity Test
急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test
首选健康成年小鼠(18g～22g)和大鼠(180g～220g) 每组10只，雌雄各半。
原则上应设对照组，方法：经口灌胃法一次染毒，染毒后继续禁食3h～4h
试验前动物要在试验环境中至少适应3～5d时间，观察期限一般为17d。
对死亡动物进行尸检。
观察期结束后，处死存活动物并进行大体解剖，如有必要，进行病理组织学检查。
亚慢性经口毒性试验Subchronic Oral Toxicity Test
首选大鼠，每一剂量组实验动物至少应有20只，雌雄各半，一般设三个染毒组和一个对照组。
方法：连续染毒3个月（90d），有时侯可根据需要染毒6个月（181d），每周7d染毒。
在全程染毒结束后继续观察一段时间(一般不少于28d)。
染毒开始前至少要有7d 时间使实验动物适应实验室饲养环境
检测指标：●每日一次临床观察●临床血液生化检查
●每日测量一次饲料消耗量,每周测体重一次●尿液检查
●眼科检查●大体解剖
●血液学检查●病理组织学检查。
(中山毒理课件)实验二、经口急性毒性试验
2、受试物的配制 （1）灌胃容量：0.1ml/10g （2）最高剂量组浓度＝最高剂量/灌胃容量 雄性60mg/kg/0.1ml/10g＝6mg/ml 雌性50mg/kg/0.1ml/10g＝5mg/ml （3）每组溶液的实际需要量 V＝最低体积＋耗量 ＝动物数×平均体重×灌胃量＋耗量 ＝10*25g*0.1ml/10g+2.5ml ＝5ml
（4）最高剂量组溶液配制 雄性A＝V*k/（k－1） ＝5*1.15/ （ 1.15-1) ＝38ml 雌性A＝V*k/（k－1） ＝5*1.2/ （ 1.2-1) ＝30ml k为等比级数
• （5）等比稀释 雄性 38×（1/K）=33 雌性 30× （1/K）=25
• 四、给药方法及途径 等容量给药：小鼠 0.1ml/10g 途径：经口灌胃
• 要求：
1、掌握动物随机分组及标记方法 2、掌握测定LD50的实验设计原则 3、巩固小鼠的灌胃技术
LD50的优点
• LD50是评价化学物质急性毒性大小最重 要的参数，也是对不同化学物进行急性 毒性分级的基础标准。 • 是非常快速的可以计算得到。
• 急性毒性： 指机体一次接触或24小时内多次接触化 学物后在短期（最长到14天）内所发生的 毒性效应，包括一般行为、外观改变、大 体形态变化以及死亡效应。 注意事项： 1）、急性接触的次数 2）、中毒效应出现的时间 3）、中毒效应的强度
实验设计的原则
• 一、实验动物的选择 1、种属与品系（昆明小鼠） 2、年龄体重(同一组最大组与最小组差异不 得超过20%、组间变异不应超过10%） 3、性别 4、分组 5、检疫期 6、给药前禁食处理 7、受试物（克百威）
二、分组标记： 1、本实验采用改进寇氏法计算LD50,各组 动物数相同;每组10只；各组剂量组距成 等比级数；死亡率呈正态分布（最低剂量 组﹤20％，最高组﹥80％） 除改进寇氏法外，还有霍恩（Hor法）、 序贯法、Bliss法。
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实习内容
试验动物的选择和性别鉴定。
试验动物的称重、编号以及随机分组方法。 急性毒性试验常用染毒途径和方法。
急性毒性反应的观察和LD50计算。
实验材料
(一) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。
(二) 器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，
10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、
灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物 体重秤、外科剪刀、镊子。
(三) 试剂
受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液 或其它染色剂。
实验动物的选择(提问)
实验动物的性别鉴定
♀
♂
分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。
表3 调配后30只动物随机分组
组别 A 1 14 鼠号 17 19 23 组别 D 4 9 鼠号 25 26 27
B
C
5
7
8
16
10
20
13
22
15
29
E
F
2
3
6
11
12
18
24
21
28
30
实验动物染毒途径和方法（示教）
常用的染毒途径： 经口染毒 经呼吸道染毒
面向自己,沿着门牙左 边滑入
气管
By LASCO
食道
经皮染毒
注射途径染毒
吸收速率：
静脉注射>吸入染毒>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射> 经口染毒>皮内注射>其他染毒途径如经皮等
受试物的配制
1、受试化学物的量取
(1)、称量法--固体化学物
(2)、吸量法--液体化学物
2、受试化学物的稀释
(1)、等浓度稀释法
一般是采用少量动物(2~3只为一组)，拉大组距，逐渐
缩小，找出受试物0%和100%死亡剂量。
正式试验
经预试验求出受试化学物的致死剂量范围(即死亡率10%90%的剂量范围)，再以下式求出正式试验的剂量组距(i) 值。
logLD90 - logLD10 i n -1
i—表示相邻的两个剂量组，剂量对数之差或相邻两组剂 量比值的对数值；
出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠O.5～1ml，大鼠
4～5m1。
(2)、等容量稀释法
寇氏法
Karber法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈S型
曲线所包括的面积推导出死亡率为50%的剂量；
此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动
物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最 低剂量组死亡率<20%，最高剂量组>80%。
预实验
目的是为了确定正式实验的剂量范围。
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
皮毛 眼睛
其他
小鼠氟化钠经口急性毒性测量
表4
受试物名称: 实验日期: 实验动物种系： 组别 剂量(mg/m3) 动物编号 性别
急性毒性症状记录表
结构式： 室 温： 体重(g) 症状出现时间 死亡时间
LD50的计算—寇氏法
其中：
计算公式:
m : 1ogLD50; Sm: 标准差; Σp : 各组死亡率总和; p : 各组死亡率; q : 1－ p i ：相邻两组对数值之差 n ： 每组动物数;
实验二 经口急性毒性试验 Acute Oral Toxicity Test
Dept. of Toxicology School of Public Health Xinjiang Medical University
目的要求
掌握实验动物的常用染毒途径和方法。 掌握半数致死浓度的测定方法和结果评定。
小鼠（Mouse）
大鼠（Rat）
实验动物的称重
大、小鼠秤的感应量需在0.1g以下。 同一组内、同性别动物体重差异应
小于平均体重的10%。
不同组间同性别动物体重均值差异
应小于5%。
急性毒性实验一般使用体重为18-
22g的小鼠或/和180-220g大鼠。
实验动物编号的标记方法
颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）： 红色：0.5%中性红或品红溶液 黄色：3-5%苦味酸溶液（水） 80-90%苦味酸酒精饱和溶液 咖啡色：2%硝酸银
3
4 5
21.7
26.1 31.3
1.3361
1.4161 1.4961
10
10 10
5
7 9
0.5
0.7 0.9
0.5
0.3 0.1
0.25
0.21 0.09
i=0.08
Σp=2.3
举例：LD50的计算—0.08(2.3 0.5) 1.3521 0.16 0.25 0.21 0.09 S m 0.08 0.0213 10
lgLD50 及其95%可信限为1.3521±1.96×0.0213＝1.3521±0.0417 lgLD50 及其95%可信区间范围为22.50mg/kg(20.44~24.76mg/kg)
举例：LD50的计算——寇氏法
外源化学物急性毒性分级（WHO）
6 只大鼠吸入 大鼠一次经口 兔经皮 4hr，死亡 2～ 4 LD50(mg/kg) LD50） （mg/kg） 只的浓度 （ppm） <1 1～ 50～ 500～ 5000～ <10 10～ 100～ 1000～ 10000～ <5 5～ 44～ 350～ 2180～ 对人可能致死的估计量 g/kg <0.05 0.05～ 0.5～ 5～ >15 总量（g/60kg） 0.1 3 30 250 >1000
规定：
余数：1、2、3、4、5、6分别对应A、B、C、D、E、F 组
实验动物调配
按上法分组后，A组有动物7只，B组7只，C组6只，D组与E组各2只，F 组6只。为了使每组动物数均为5只，需要根据随机分配的原则再选出2
只A组和1只C组动物给D组。B组选出2只，F组选出1只给E组。
表2 初步分组结果
n—为设计的剂量组数；
求得值后以最低剂量组的剂量值加上一个即是第二个剂 量组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数 及得出各组剂量的真实值。
小鼠氟化钠经口急性毒性测量
啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容 （1）
系统器官 中枢神经系统及神经肌肉系统 观察及检查项目 行为 动作 对各种刺激的反应 大脑及脊髓反射 肌肉紧张力 瞳孔大小 分泌 呼吸系统 鼻孔 呼吸性质和速率 流鼻涕 弛缓、困难、潮式呼吸 中毒后一般表现 改变姿态、叫声异常、不安、安静 震颤、运动失调、麻痹、惊撅、强制性动作 易兴奋、被动、缺乏知觉、知觉过敏 减弱、缺乏 强直、弛缓 扩大或缩小 流泪、出汗
m Xk i(p 0.5)
pq Sm i n
Xk ：最大剂量的对数值
举例：LD50的计算——寇氏法
表5 某化学物质小鼠经口染毒死亡情况 组别 1 2 剂量 mg/kg 15 18 对数 1.1761 1.2561 动物数 死亡数 死亡率 存活率 （只） （只） （p） （q） 10 10 0 2 0 0.2 1 0.8 p.q 0 0.16
植物神经系统
小鼠氟化钠经口急性毒性测量
啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容 （ 2）
系统器官 泌尿生殖系统 观察及检查项目 阴户、乳腺 阴茎 会阴部 颜色、张力、完整性 眼硷 眼球 透明度 直肠或皮肤温度 一般情况 中毒后一般表现 肿胀 脱垂、遗精 污秽、有分泌物 皮肤充血、紫组、皮毛松弛、污秽 上睑下垂 突出，充血，震颤 混浊 降低、升高 姿态不正常、消瘦
黑色：煤焦油的酒精溶液
单 色 法
大小鼠标记方法（单色法n<10）
单色法标记原则：单色 法编大于10的号码时，
我们规定顺时针旋转，
后一位必需大于前一位 数，例如：可以编，12，
13，14……19，但不能
编10，11，20，21，22， 30，31，32，33，等， 以此类推。100以内最 大能编89号。
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整