GUS染色液配制
GUS染色液
南京森贝伽生物科技有限公司 网址：/第1页 仅供科研版本号：181126GUS 染色液【产品组成】【保存条件】-20℃,避光;4℃,避光,12个月【产品概述】GUS(β-Galactosidase)基因是存在于E.coli 等一些细菌基因组内的编码β-葡萄糖苷酸酶的一种水解酶，该基因常作为融合标记用于植物转基因分析和调控研究中。
GUS 受体基因系统有表达E.coliGUS 酶的稳定性和在植物内的低活性，绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。
5-Bromo-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide ，cyclohexylammonium salt(简称为X-Gluc 或X-GlcA)分子量为521.8，CAS 号为18656-96-7，是检测大肠杆菌中GUS 基因的底物，可快速检测植物中GUS 基因融合标记。
β-葡萄糖苷酶基因染色试剂盒(β-Galactosidase Reporter Gene Staining Kit)简称为GUS 染色液，其染色原理是适宜的反应条件下β-葡萄糖苷酶(GUS)可将X-Gluc 水解成蓝色物质，该物质不溶解于转基因的细胞核组织中的靛蓝物质，具有GUS 活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到，GUS 染色液可用于生物化学活性分析、免疫分析以及组织和细胞的组织化学染色，多用于转基因植物的GUS 基因表达分析。
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
【使用方法】1、配制X-GlcA Solution ：取X-GlcA Solvent 229μl 加入至80mg X-GlcA 中或取适量上述2种物质溶解，使其浓度达到350mg/ml ，轻轻Vortex 混匀，即为Solution ，分装后，-20℃避光保存。
2、按下列比例配制GUS 染色液：3、固定(①取转基因植物组织，入3～5ml清洁小瓶或多孔板中。
GUS步骤
按下表1配制GUS染色的底物。
表1. GUS染色底物的配制
试剂名称
母液浓度
母液配制方法
工作液浓度
工作液配制方法
磷酸缓冲液（pH 7.2）
0.5M
将0.5M Na2HPO4和0.5M NaH2PO4混合*
50mM
1 ml
Triton X-100
10%
取10ml Triton X-100溶于水，定容至100ml。
10 mM
0.2 ml
X-Gluc
/
2 mM
10.4mg
ddH2O
/
/
定容至10ml
* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。
1.2 染色步骤
（1）将材料在90%丙酮中(冰浴)轻微固定15-20min；
（2）在缓冲液中(染色液去掉X-Gluc)漂洗3次，共计l0min；
（3）将需要染色的拟南芥植株或组织放在1.5 mL离心管中，加入染色液浸过材料抽气5-l0min，37℃过夜，染色12-16h；
（4）用50%，60%，70%，80%，90%乙醇依次脱水30min后，在100%乙醇中放置1h；观察、照相(BX50 OLYPUS，显微镜)。
0.1%
0.1 ml
铁氰化钾K3Fe(CN)6
100mM
将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。
2 mM
0.2 ml
亚铁氰化钾
K4[Fe(CN)6溶于水，定容至100ml。
2 mM
0.2 ml
MS培养基和GUS染色
MS培养基1、大量元素母液的配制（配0.5L）无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大20倍，分别用50ml 烧杯称量，用蒸馏水溶解，必要时加热。
溶解后，倒入500ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容。
在混合定容时，必须最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢钾能形成难溶于水的沉淀。
将配好的混合液倒入细口试剂瓶中，贴好标签。
配制培养基时，每配1000ml培养基，取大量元素母液50ml。
化合物名称每升培养基用量（mg/L）扩大20倍称量（g/0.5L）备注NH4NO3 1650 16.5 每升培养基取母液50ml KNO3 1900 19.0KH2PO4 170 1.7MgSO4●7H2O 370 3.7CaCl2●2H2O 440 4.42、微量元素母液的配制（配0.5 L）无机盐中微量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大100倍，分别用50ml 烧杯称量，用蒸馏水溶解，必要时加热。
溶解后，倒入500ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容。
化合物名称每升培养基用量（mg/L）扩大100倍称量（mg/0.5L）备注MnSO4●4H2O 22.3 1115 每升培养基取母液10ml ZnSO4●7H2O 8.6 430H3BO3 6.2 310KI 0.83 41.5Na2MoO4●2H2O 0.25 12.5CuSO4●5H2O 0.025 1.25CoCl2●6H2O 0.025 1.253、铁盐母液的配制（配0.5 L）目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。
这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。
常常配成200倍母液，溶解时可加热。
化合物名称每升培养基用量（mg/L）扩大200倍称量（g/0.5L）备注Na2EDTA 37.25 3.725 每升培养基取母液5ml FeSO4●7H2O 27.85 2.7854、有机物母液的配制（配0.5 L）MS培养基中，有机物为甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫氨素（V-B1）、盐酸吡哆素（V-B6），常常配成1000倍或100倍母液。
GUS染色液配制
GUS染色液配制2篇【文章一】GUS染色液配制原理及方法GUS染色液是一种用于检测植物细胞中β-葡萄糖苷酸酯酶（GUS）活性的染色液。
本篇将介绍GUS染色液配制的原理及方法。
一、原理GUS染色液配制的原理是基于GUS酶催化水合酶活性，使含有1-甲基-β-吡喃糖苷（X-Gluc）的染色底物在酶的作用下发生蓝色沉淀反应。
该底物被GUS酶水解后可产生自由的5,5’-二溴-4,4’-二氯-3’-靛酚（X）和5-溴-4-氯-3-（2,6-二甲基-4-氧代酰基苯氨基）苯甲醇（Gal）。
这两种产物在碱性条件下进行聚合反应，生成可见的蓝色沉淀。
二、方法1. 准备所需材料：pH 5.0缓冲液、10% Triton X-100、X-Gluc染色底物（20mg/ml），甲醇，硫酸铵，硼酸，氢氧化钠，孵育液。
2. 配制pH 5.0的缓冲液：取适量的硼酸和氢氧化钠，配制一定浓度的缓冲液，并将溶液调至pH值为5.0。
3. 配制10%的Triton X-100：取适量的Triton X-100，加入适量蒸馏水溶解，使其浓度为10%。
4. 配制X-Gluc染色底物溶液：取适量X-Gluc，加入适量甲醇溶解，制成浓度为20mg/ml的X-Gluc溶液。
5. 配制孵育液：将硫酸铵和甲醇按一定比例混合，制成适量的孵育液。
配制步骤：1. 取适量的pH 5.0缓冲液，加入10% Triton X-100，并充分混合。
2. 加入适量的X-Gluc染色底物溶液，再次充分混合。
3. 加入适量的甲醇和孵育液，并充分混合。
4. 将配制好的GUS染色液过滤，以去除杂质颗粒，得到高纯度的染色液。
5. 将GUS染色液储存于4℃的冰箱中，避光保存。
三、注意事项1. 在配制GUS染色液时，应注意避免阳光直射和长时间的暴露。
2. 染色底物X-Gluc是一种易燃物质，使用时应注意安全操作。
3. 配制过程中的工具和容器应干净无杂质，以防止污染。
4. 孵育液的制备要按照所需配比进行，过量或不足都会影响染色效果。
GUS染液配方
GUS染液配方
100mM sodium phosphate buffer (pH7.0) 磷酸钠缓冲液
0.1% Triton X-100
0.1% N-laurylsarcosine（十二烷基肌氨酸纳）
10 mM Na2EDTA
1 mM K3Fe(CN)6铁氰化钾
1 mMK4Fe(CN)6亚铁氰化钾
0.5 mg/mL X-Gluc
100mM sodium phosphate buffer (pH7.0) 磷酸钠缓冲液的配制方法：
计算方法：
pH7.0时，Na2HPO4.12H2O占61%，NaH2PO4.2H2O占39%
配制100ml时，所需Na2HPO4.12H2O的量为：100*10-3*0.1*358.14*0.61=2.18 g 所需NaH2PO4.2H2O的量为：100*10-3*0.1*156.01*0.39=0.61 g
GUS染液配制方法（500ml）：
1. 分别称取10.92 g Na2HPO4.12H2O和3.04 g NaH2PO4.2H2O溶于400ml蒸馏水中；
2. 依次将0.5g十二烷基肌氨酸纳、1.86 g Na2EDTA、0.16 g铁氰化钾、0.21 g亚铁氰化钾和500ul Triton X-100加入磷酸缓冲液中，完全溶解后，定容至500 ml;
3. 根据实验需要取一定量的上述溶液，如100ml，称取0.05 g X-Gluc溶于溶液中，遮光保存。
若准备长时间之后用，将其分装后保存与-20度。
各种试剂分子量：Na2EDTA
K3Fe(CN)6
K4Fe(CN)6。
GUS染色液使用说明
GUS染色液使用说明货号：G3061有效期：6个月产品内容:名称规格贮存X-gluc粉末20℃X-gluc溶解液1ml RTGUS染色缓冲液50ml4℃产品说明:Gus(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（x-gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus 基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。
GUS染色试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将配制好的X-gluc溶液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染色液。
操作步骤：一、X-gluc溶液(50×)配制：吸取1ml X-gluc溶解液加入到X-gluc管中，彻底混匀，至粉末完全溶解，即配成X-gluc 溶液(50×)，该溶液-20℃避光保存。
注：正常的X-gluc溶液颜色为无色，如果溶液变为红色或棕色，表明溶液失效。
二、GUS染色工作液配制：GUS染色工作液配制量1ml5ml10mlX-gluc溶液(50×)20μl100μl200μlGUS染色缓冲液1ml5ml10ml注：GUS染色工作液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
三、GUS染色步骤：1.预处理：将叶片、花瓣、根茎等组织剪成小片，放于1.5ml离心管中，加入预冷的90%丙酮完全覆盖材料，常温处理20-30分钟。
此步骤可以预固定组织并且可以去除部分叶绿素。
注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。
例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。
GUS染色液使用说明
GUS染色液使用说明货号：G3061有效期：6个月产品内容:名称规格贮存X-gluc粉末20℃X-gluc溶解液1ml RTGUS染色缓冲液50ml4℃产品说明:Gus(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（x-gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus 基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。
GUS染色试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将配制好的X-gluc溶液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染色液。
操作步骤：一、X-gluc溶液(50×)配制：吸取1ml X-gluc溶解液加入到X-gluc管中，彻底混匀，至粉末完全溶解，即配成X-gluc 溶液(50×)，该溶液-20℃避光保存。
注：正常的X-gluc溶液颜色为无色，如果溶液变为红色或棕色，表明溶液失效。
二、GUS染色工作液配制：GUS染色工作液配制量1ml5ml10mlX-gluc溶液(50×)20μl100μl200μlGUS染色缓冲液1ml5ml10ml注：GUS染色工作液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
三、GUS染色步骤：1.预处理：将叶片、花瓣、根茎等组织剪成小片，放于1.5ml离心管中，加入预冷的90%丙酮完全覆盖材料，常温处理20-30分钟。
此步骤可以预固定组织并且可以去除部分叶绿素。
注：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。
例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。
GUS组织化学染色方法
GUS基因组织化学染色
将共培养后的材料从培养基中取出，用蒸馏水洗去残留菌体，切至0.2cm大小，放入离心管中，加入Buffer A至没过愈伤组织，置于37℃环境中，侵泡1 h。
用移液枪将Buffer A 吸出，加入Buffer B至没过愈伤组织，置于37℃黑暗环境中染色，至材料出现蓝色。
若叶绿素影响观察，可用75%乙醇漂洗材料，做脱色处理。
最后用蒸馏水将材料洗净，观察统计染色数。
Buffer A成分如下：
0.2 M NaPO4 buffer （PH 7.0）25 ml
蒸馏水23.75 ml
0.1 M K3[Fe(CN)6] 0.25 ml
0.5 M Na2EDTA 1 ml
Total 50 ml
其中0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由0.2 M Na2HPO4和0.2 M NaH2PO4配制而成。
每100ml的0.2 M NaPO4 buffer（PH 7.0）溶液由62 ml 0.2 M Na2HPO4和38 ml 0.2 M NaH2PO4混合而成。
Buffer A置于4℃保存。
Buffer B由Buffer A和X-gluc 1：1混合配制而成。
Buffer B置于-20℃，避光保存。
GUS染色液配制
一染色液配制1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。
2）X－Gluc基液（50mM PBS，pH7.0）。
配制方法：50mM NaH2PO4·0.78g/100ml；50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解；Na2EDTA （10mM，372mg），Triton-100（0.1％，100μl）,K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（0.5mM，16.5mg）K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（0.5mM，21.1mg）染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液需要试剂：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）；N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ；NaH2PO4；Na2HPO4 ；Na2EDTA ；Triton-100；K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）二染色方法：1.将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃保温1小时至过夜。
2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3次，至阴性对照材料呈白色。
3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
三实验原理适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
GUS染色及相关溶液配制
GUS染色（1）测量称重的同时另取20株幼苗经行GUS染色，注意选取长势近似的植株。
（2）用吸水纸吸干表面水分后切除苗，保持根部完整，装入量程适当的离心管中，贴好标签标记处理。
（3）用移液枪加入适量GUS缓冲液，加入缓冲液后用锡箔纸包裹离心管，盖好离心管后晃动几下，再加入GUS底物，保证1ml染液中GUS缓冲液950ul，GUS 底物50ul的比例，染液总量可浸没所有种子和根为宜。
（4）将用锡箔纸包裹好的离心管捆扎好，放于37℃ 200rad的摇床上过夜，可至24 h。
GUS染液的配方50 ml 100 ml 500 ml1 M NaH2PO47.8 g 15.6 g 78.005 g1 M Na2HPO417.91 g 35.81 g 179.08 g0.5 M9.31 g 18.61 g 93.1 gEDTA(PH=8)Triton X-100 10 ml 20 ml 100 ml0.5 M 亚铁氰化钾10.55 g 21.1g 105.5 g0.5 M 铁氰化钾8.25 g 16.5 g 82.5 gX-Gluc 50 mg 100 mg 500 mgGUS 染液的配置以500 ml GUS 染液为准，配比如下GUS母液配比（每500 ml）1 M NaH2PO421.15 ml1 M Na2HPO428.85 ml0.5 M EDTA(PH=8) 1 mlTriton X-100(20%) 25 ml0.5 M 亚铁氰化钾 5 ml0.5 M 铁氰化钾 5 mlX-Gluc 500 mg注：已知1 M的磷酸钠缓冲液（PH=7）中V（NaH2PO4）：V (Na2HPO4) = 42.3 : 57.7亚铁氰化钾K4Fe(CN)6.3H2O铁氰化钾K3Fe(CN)6GUS染液体系GUS 缓冲液GUS 底物3 mL 体系2850 μl150 μl5 mL 体系4750 μl250 μlGUS脱色（1）配置稀释过的NaClO溶液，浓度在3%左右（因NaClO易分解，详细浓度无法精确），配置好后封口避光保存。
GUS染色液 试剂盒
GUS染色试剂盒使用说明书产品货号：SL7160包装规格：50ml保存条件：GUS染色浓缩液（50×）-20℃保存，GUS染色缓冲液4℃保存，保质期12个月。
GUS染色液建议现用现配。
产品内容：产品简介：gus(β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶)基因是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X-Gluc）分解为蓝色的物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。
该试剂盒包含GUS染色的全部试剂，使用方便，只需将染色液和缓冲液按照比例混合即配成GUS染色液。
该试剂盒可以配制50ml GUS染色液。
使用说明：GUS染色液配制：GUS染色浓缩液使用前用GUS染色缓冲液稀释50倍即配成GUS染色液。
如0.1mlGUS染色浓缩液加入到5ml GUS染色缓冲液中，即配成5ml GUS染色溶液。
该染色溶液最好现用现配，短期贮存可以-20℃保存2-3天。
GUS染色步骤：1.将准备好的材料浸泡在GUS染色液中，于25-37℃保温1小时至过夜。
2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。
3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。
注意事项：用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。
例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。
但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-3mm）。
当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。
植物组织GUS染色方法
GUS染色试剂配制1. 50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）：A液：称取NaH2PO4●2H2O 3.12g溶于无菌蒸馏水，定容100ml；B液：称取Na2HPO4●12H2O 7.17g溶于无菌蒸馏水，定容100ml；取39ml A液与61ml B液混合。
2．染色液：50mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中含有：0.1 mol/L K3[Fe(CN)6]，0.1 mol/L K4[Fe(CN)6]，10mmol/L Na2EDTA，0.001%（v/v）Triton-X100，20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc。
3．一般固定液：1%甲醛，50mmol/L磷酸钠缓冲液，0.05% Triton X-100（或Tween-20）。
4．FAA固定脱色液：5%甲醛，5%乙酸，5%乙醇。
染色直接染色法1．将准备好的试材浸泡在染液中，于25~37℃保温1h至过夜。
2．叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2~3次，至阴性对照材料呈白色。
3．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
固定染色法1．将材料浸入固定液，必要时刻抽真空1min，室温下轻摇30~60min。
2．取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3~4次。
3．将材料放入无菌离心管中，加入染色液，浸没材料，盖上盖子，于37℃水浴中保温几分钟至过夜。
4．取出材料，用75%的乙醇漂洗，或放入FAA固定液中20min。
5．先后用20%乙醇，50%乙醇个浸泡20min以上。
6．显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
7．染色后的材料可浸入含80%乙醇的FAA固定液中保存。
GUS组织化学染色
GUS组织化学染色试剂：GUS染色液（200ml）：X-Gluc 100mg； 50mM k4[Fe(CN)6] 2 ml; 50 mM k3[Fe(CN)6] 2 ml；0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 4 ml; 甲醇 5ml；Triton X-100 0.2ml; 加入50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）补足200ml；无菌膜过滤。
X-Gluc：100mg溶于1ml DMF，保存于4℃50 mM k3[Fe(CN)6]： 0.824g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃50 mM k4[Fe(CN)6]： 1.056g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）：先配:0.2M Na2HPO4：称取71.632g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水中，0.2 M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水中，然后：62ml的0.2M Na2HPO4与38ml的0.2 M NaH2PO4混合，加蒸馏水稀释至400ml。
二、实验步骤：1. 取新鲜烟草叶片组织于90%丙酮中固定20 min；2. 弃丙酮，加入适量GUS染色液（不含X-Gluc）润洗一遍；3. 加入GUS染色液，真空处理20 min；4. 37℃孵育24h；5. 无水乙醇浸泡24h，除去叶绿素；6. 观察结果并照相。
烟草叶片GUS活性的荧光定量测定MrBAS基因启动子转基因烟草叶片组织器官的GUS活性定量分析以GUS蛋白荧光测定完成,表2 GUS蛋白提取缓冲液TabIe.2 GUS protein extraction buffer组分母液体积50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 50 mL10 mmol/L Na2-EDTA 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL10 mmol/L β-巯基乙醇β-巯基乙醇100μl0.1% TritonX-100 Triton X-100 100μl0.1% SDS 10% SDS 1 mLddH20 补足 100 mL烟草叶片总蛋白的提取1) 取超低温冰箱保存的样品材料并用液氮充分研磨成粉末，分别称取1.2g样品组织于离心管中；2) 向离心管中分别加入1mL GUS蛋白提取缓冲液，涡旋混匀，冰上放置2h至沉淀；3) 4℃ 6000 r/min 离心 20min，收集上清液；4) 滤纸过滤，去除植物组织残渣；5)吸取200μl上清液，保存在4℃冰箱中待用(考虑到GUS蛋白的活性,时间以一周内为宜)。
gus基因检测
gus 基因PCR 反应程序： 94℃预变性5 min 94℃变性1 min58℃退火1 min 30个循环 72℃延伸2min 72℃延伸7 mingus 基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC 3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA 3’GUS 染色母液:X-Gluc 由DMSO 溶解，贮存浓度为l0mg/mL,于-20°C 保存。
GUS 染液:500mg/L X-Gluc, 0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.lmol/L K4Fe(CN)6，0.0lmol/L ，的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml●这是1ml的配方体系：终浓度药品分子量体积0.5M Na2EDTA 20ulTritonX-100 1ul1M 磷酸钠缓冲液（PH7.0） 100ul0.1M K3Fe(CN)6 5ul0.1M K4Fe(CN)6 5ul10mg/ml X-Gulc 200ul去离子水或无菌水669ul染液配方0.05M磷酸缓冲液 4.48ml 5mM铁氰化钾0.05ml, 5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-100 0.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05ml DMF中，终浓度为0.5mg/ml37度染色过夜1.2染色步骤1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。
2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
4)记录：在体视显微镜下拍照记录。
2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。
革兰氏染色液配制
革兰氏染色液保质期：2-8度一年.革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，媒染剂碘液进入菌体后与结晶紫结合，革兰氏阳性菌对碘与结晶紫摄取量多且牢固，不易被酒精脱色。
革兰氏阴性菌对碘与结晶紫摄取量少，不牢固，易被酒精脱色。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
操作步骤：1、标本处理：（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。
（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。
2、涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。
制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
3、染色方法：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都可能会呈阴性反应。
（1）.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）.加上碘液后染色1分钟，水洗。
（3）.加上95%酒精,摇动玻片,根据涂片厚度,脱色约30-60秒，水洗,吸去水分。
（4）.加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）.吸干或在空气中凉干后，油镜镜检。
4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。
注意事项：1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
4．碘液变透明，则不能使用。
5.水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
革兰氏染色液如果用量少，买现成的比较话算，如果用量大，自己配起来也溶液，就是试剂种类多了点。
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G U S染色液配制 Prepared on 24 November 2020
一染色液配制
1）X－Gluc母液：X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20℃。
2）X－Gluc基液（50mM PBS，）。
配制方法：
50mM NaH2PO4·100ml；
50mM Na2HPO4 100ml共同溶解；
Na2EDTA （10mM，372mg），
Triton-100（％，100μl）,
K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）（，）
K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）（，）
染色液：50μl X-Gluc母液＋450μl基液
需要试剂：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）；
N-N-二甲基甲酰胺(DMF) ；
NaH2PO4；
Na2HPO4 ；
Na2EDTA ；Triton-100；
K3 [Fe(CN) 6] （铁氰化钾）；
K4 [Fe(CN) 6] （亚铁氰化钾）
二染色方法：
1.将准备好的试材浸泡在染液，于25—37℃保温1小时至过夜。
2.叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2—3次，至阴性对照材料呈白色。
3.肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为Gus表达位点。
三实验原理
适宜的反应条件下，β- 葡萄糖苷酸酶（GUS）可将X－Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
gus基因是目前常用的一种报告基因，是β－D－葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β－葡萄糖苷酸，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X－Gluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。
其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。
gus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的具体细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。
四注意事项
用于染色的植物材料的制备方法要因涉及的特定组织和器官的不同而异。
例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。
但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶就必须在染色前切成薄片（1-
3mm）。
当操作大的组织和样品时，可以选用真空渗入法来帮助底物和酶渗入细胞。