拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定

拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变

体鉴定

徐文晶;程玉祥

【摘要】To explore information and physiological function of nucleoside phosphorylase genes,by using PCR method,the authors examined gene expression of nucleoside phosphorylase in different tissues of model plant arabidopsis, and further screened T-DNA-inserted mutants of these genes. Results:Transcriptional expression of At4g28940 and At4g28940 is high in root tissues ,and slight transcript levels are detected in other tissues ,while At4g24350 gene expression is low in various tissues .After the identification of T-DNA insertion and transcriptional levels of the

genes ,the knockout mutants of At4 g28940 and At4 g24350 have been attained in this study .%为探明植物核苷磷酸化酶家族基因信息及生理功能，采用 PCR 扩增的方法，研究了模式植物拟南芥核苷磷酸化酶家族基因在不同组织中的表达，并对其核苷磷酸化酶基因 T-DNA 插入突变体进行鉴定。结果表明：

At4g24340和 At4g28940基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；At4g24350在各个组织中均有少量转录表达；经 T-DNA 插入结合转录表达鉴定，At4g28940和 At 4g24350基因为敲除突变体。

【期刊名称】《贵州农业科学》

【年(卷),期】2015(000)001

【总页数】4页(P16-19)

【关键词】拟南芥;核苷磷酸化酶;突变体

【作者】徐文晶;程玉祥

【作者单位】东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150040;东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040【正文语种】中文

【中图分类】S503.52

核苷磷酸化酶(Nucleoside phosphorylase，NP)是核苷酸补救合成途径的代谢酶[1]。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC 2.4.2.1)是核苷磷酸化酶家族的一个小亚家族，在无机磷酸存在下其可逆地催化核苷或脱氧核苷糖苷键断裂，生成嘌呤碱和一磷酸核糖或脱氧核糖[2-3]。嘌呤核苷磷酸化酶在医学上的研究报道较多，其缺乏症患者通常存在严重的免疫缺陷和神经系统功能障碍，还会引起血内尿酸不足，家族性痉挛性截瘫，脑血管病变导致的中风，多灶性白质脑病等[4-8]。植物中也存在核苷磷酸化酶，拟南芥叶绿体多核苷磷酸化酶(cpPNPase)参与r RNA和m RNA的3′末端的成熟[9-10]。然而，对于植物中核苷磷酸化酶生理功能人们了解甚少。最近有研究报道[11]，毛果杨基因组中存在13个NP-like基因，可能是一类营养储存蛋白。基于笔者实验室前期研究与分析推断，毛果杨部分核苷磷酸化酶很可能和次生细胞壁代谢与修饰相关。然而，在杨树中无法获得这些基因敲除的多重突变体用于其遗传功能鉴定。对毛果杨13个NP-like基因在拟南芥数据库BLASTP中同源检索，仅得到At4g24340、At4g24350和At4g28940同源对应基因，且目前未见这些基因的T-DNA插入突变体的相关报道。为此，笔者等选择易于获得家族基因多重突变体的模式植物拟南芥，分析其At4g24340、At4g24350和

At4g28940基因的组织表达模式，并筛选、鉴定其T-DNA插入突变体，以期为

下一步研究植物的核苷磷酸化酶的功能奠定基础。

1.1 试验材料

1.1.1 拟南芥野生型拟南芥均为Columbia型，购自ABRC(Ohio State University，USA)。

1.1.2 T-DNA插入株系 At4g28940基因的T-DNA插入株系为SALK_149317 C

和SALK_018193 C，At4g24350基因的T-DNA插入株系为SALK_072656 C，At4g28940基因的T-DNA插入株系为CS491284，均购自ABRC(Ohio State University，USA)。

1.1.3 主要试剂植物基因组DNA快速提取试剂盒、pBIOZOL Reagent和Silica Bead DNA Gel Extraction Kit，分别购自百泰克、BioFlux和Fermentas公司；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit With gDNA

反转录试剂盒，购于TaKaRa公司；引物由Invitrogen公司合成。

1.2 植物基因组 DNA、总 RNA的提取及cDNA的合成

1) 植物基因组DNA的提取。参照试剂盒说明书进行。

2) 植物总RNA提取及cDNA合成。植物材料经过液氮速冻、研碎至粉末，用4℃预冷的pBIOZOL试剂悬浮粉末后移入1.5 mL离心管，具体步骤参照pBIOZOL Reagent说明书进行。总cDNA合成采用Primescript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒。

1.3 引物设计序列及PCR扩增

SALK和CS株系插入T-DNA左臂端鉴定引物分别为LBb1:5’-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3’和LBb3:5’-TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3’。

基因引物为SALK_149317C-LP:5’-TCATACCCTAAGGTTTACTGAGT-3’和RP:5’-TATTTTGGGGTCAACTTACTCAC-3’；SALK_018193C-LP:5’-