新发突发传染病病原体的鉴定

聚合酶链反应（PCR）
模板
基本步骤和原理
变性（高温）
每一循环 退火（低温）
引物
引物
延伸（适温）
dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶
PCR原理和步骤
定量PCR ---荧光实时定量PCR
z Taqman水解探针法 z 杂交双探针法 z 分子信标（环性探针）法 z Amplisensor能量转换法等
--1994年出现首例nvCJD--1996年提出nvCJD概念 病原为朊蛋白PrP（英）
庚型肝炎病毒 H5N1禽流感病毒 Nipah病毒 西尼罗病毒 裂谷热(Rift Valley)病毒 SARS冠状病毒
庚型肝炎 人禽流感 尼巴病毒性脑炎 西尼罗病毒性脑炎 裂谷热 SARS（传染性非典型肺炎）
新发传染病－－动物传播
z Problems - 1) inconvenient and expensive, 2) not a defined system - leads to generation of virus mutants, 3) animal welfare issues,
z Advantages - 1) some viruses can only be studied in this way, 2) gives unique insight into virus pathogenesis
z 在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。
z 及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿
对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因
传染病的实验室诊断
一般检查; 生化检查; 病原学检查; 免疫学检查; 病理组织检查; 影像学检查.
细胞病变效应 (cpe)
z Some viruses kill the cells in which they replicate, often easily visible as cpe, other viruses produce little or no cpe
z Typically rounding or detaching of cells and cell fusion (syncytia)
1995 1997 1998 1999 2000 2003
幽门螺杆菌
消化性溃疡病
环孢子球虫
环型孢子虫病(顽固性腹泻)
人疱疹病毒6型
突发性玫瑰疹
丙型肝炎病毒
丙型肝炎
戊型肝炎病毒
戊型肝炎
0139霍乱弧菌
O139霍乱
巴尔道氏体
猫抓病，杆菌性血管瘤病
汉坦病毒分离株
汉坦病毒肺综合征
Sabia病毒
巴西出血热
新变异型克雅氏病(人类疯牛病) 1985年疯牛病（牛海绵状脑炎BSE）
Abundance
MS
Ionization and detection AAAAAA BBBBBB
5. Identification of pathogen by signal analysis
B A
Mass Size
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32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶
probe
probe
probe
probe
genome
genome genome
genome
检测方法：放射自显影 底物显色 化学发光
常用核酸分子杂交技术
斑点杂交（spot blot hybridization) 凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization) 原位杂交（in-situ hybridization)
免疫荧光检测
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)
From Principles of Virology , Flint et al ASM press
5号病，慢性溶血性贫血的再障危象
z 1976 隐孢子虫
隐孢子虫病，急性小肠结肠炎
z 1977 埃博拉病毒
埃博拉出血热
z 1977 嗜肺军团菌
军团病
z 1977 汉坦病毒
肾综合征出血热
z 1977 空肠弯曲杆菌
空肠弯曲菌肠炎
z 1977 丁型肝炎病毒
丁型肝炎
z 1980 嗜人T细胞病毒I型
T细胞淋巴瘤／白血病
基本思路
回答两个问题： z 是否是已知的病原体或其变种？ z 是否是完全未知的一种病原体？
基本要求：快、准
已知病原体的快速诊断
高通量的检测技术
高通量的病原体筛选技术
病原体核酸的高通量检测 技术一：多重PCR（联用技术：质谱技术、
液相芯片技术） 技术二：病原体基因芯片
病原体抗原或抗体的高通量检测 核心技术：蛋白质芯片
z 1981 金黄色葡萄球菌产毒株 中毒性休克综合征
z 1982 大肠埃希菌O157：H7 出血性结肠炎
z 1982 嗜人T细胞病毒11型 毛细胞白血病
z 1982 伯氏疏螺旋体
莱姆病
z 1983 人类免疫缺陷病毒
艾滋病(HIV)
1973年以来部分新发的传染病(续)
1983 1986 1988 1989 1990 1992 1992 1993 1994 1994
传统的和常规的病原学诊断
z 分离培养(细胞,组织动物); z 显微镜检查(光学和电子显微镜); z 抗原成分检测(ELISA,免疫荧光等); z 分子生物学基因诊断(核酸杂交,PCR等);
Electronmicrographs
Adenovirus
Rotavirus
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
新发传染病的病原体？？？
病原学发现的“科赫三定律”
一、每种传染病必定能发现其病原体； 二、能培养出该病原体的纯种； 三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以
产生相同的病变。
确定一种疾病病原体的基本步骤
分离到该病原体
建立该病原体的鉴定方法
动物试验 临床实验室诊断 流行病学研究等
最终确定病原体与疾病的病因学关系
Photocleavable linker and spacer
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Cleavage of mass tags from amplicon Ultraviolet Light
A
B
Purified samples
96-well thermocycler plate
2. PCR purification on filter plate
30 minutes
3. Elution into 96-well loading plate for mass spectrometer analysis
From Principles of Virology , Flint et al ASM press
实验动物
Laboratory animals - animal models of human infection. Historically the only way to study viruses was from animal to animal.
z大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正 肆虐全球的禽流感。
z每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生 虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。
z前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋 病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流 感等难抗病毒。
z研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其 中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。
新发突发传染病病原体的 诊断技术
上海市（复旦大学附属）公共卫生中心 应急检测实验室 胡芸文
Ebola virus
Virus
Protozoan
Algae
Rotavirus
Bacterium
Friend or Foe?
1973年以来部分新发的传染病
z 1973 轮状病毒
婴儿腹泻的主要病因
z 1975 细小病毒819
Current Respiratory Panel
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NUCLEIC ACID CONJUGATED MASS TAGS
Variable mass unit
MS sensitivity enhancer
新病原体的特征
z 现时人类新传染病的病原体，多属于核糖 核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病 毒，可于短时间内发生突变，并容易适应 新宿主，令跨种物传播机会变得更大。
人类与传染病较量中的四方面重大 突破
隔离检疫制度的建立; 病原微生物的发现; 特效药物的出现; 疫苗的诞生 .
快速诊断是关键
DETECTION OF 58 DIFFERENT MASS TAGS BY APCI-MS
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多重 PCR-质谱联用技术
Multiplex PCR-Mass Tag system
美国哥伦比亚大学Lipkin 研究组发明了一种基 于multiplex PCR-MassTag（多重PCR与质谱联用） 的高通量病原体快速筛选技术。
优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了 multiplex PCR引物设计的适应性和灵活性，使 检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产 物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限 或荧光染料种类的局限。
与人类行为及环境的改变有关
z 过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中 四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡 出血热、SARS及禽流感等。
z 丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普 及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上 的病原体容易产生突变，感染人类。
z 一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴 身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更 演变成世纪绝症。
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RESPIRATORY SYNDROME PANEL
PCR-Mass Tag system
1. PCR amplification with conjugated primers
90 minutes A
B
A
B
4. Automated sample injection, photocleavage and detection
1:30 minutes/sample
应用
目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模 块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检 测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测 模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已 开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的 分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这 一技术具有足够的发展前景和潜力。
z Embryonated eggs
From Principles of Virology , Flint et al ASM press
核酸诊断的发展史
z 核酸分子杂交 z 聚合酶链反应（PCR） z 核酸定量分析
核酸的直接检测 定性PCR
Leabharlann Baidu
核酸扩增检测(PCR) 定量PCR
核酸分子杂交(nucleic acid molecula hybridization)