高通量测序RNA-seq数据的常规分析

案例一

虽然RNA-seq早已被大家所熟知，特别是在高通量测序越来越便宜的今天，但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用，参数设置，参考基因组准备，输出结果的解读等等，都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。

哈哈，不用怕，有云生信，这都不是事儿！今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前，我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程，请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程：根据实验设计，提取细胞RNA，并将RNA提交给测序公司，就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库，上机测序。拿到测序数据后，就到了我们大显身手的时候了。首先，我们要对测序结果做个简单的质量评估，剔除低质量的数据。然后，根据基因组数据（这里我们讲的是基因组数据已知的物种，基因组未知的有套独立的流程，这里不讲），将测序数据组装。根据组装结果，计算基因或转录本的表达量。最后，同芯片数据一样，我们可以根据表达量数据做很多分析，如差异表达分析，网络分析（包括蛋白互作网络，共表达网络等），也可以结合临床数据做分析（如预后，亚型分类、关联，药效等）。

图 1. RNA-seq常规分析流程

叨叨完毕，进入正题。

进入尔云后，打开“测序数据处理”模块，我们会看到图2的结果。在这一模块，我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步：1、数据质控和过滤低质量数据；2、基因组组装，计算基因表达量。对于上面两部，尔云又根据是双端测序还是单端测序，分了两块。以edgeR 为例，输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表，有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。

图 2. 测序数据处理模块

质控结束后，尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果，好多好多呀，可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE，该表格是对质控前后的数据统计，反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据，是第2步组装的输入文件。

图 3.质控结果

组装完成后，会返回一个expression.txt的表达矩阵文件，该文件是下一步差异表达分析的输入分析。

得到表达矩阵后，我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块（如下图所示），它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq

数据，有DESeq，edgeR和NOISeq三中差异表达分析方法。小白们只需要输入按照要求输入文件，设置参数，点保存即可。

图 4.差异表达分析模块

在差异分析的基础上，尔云还可以做功能富集分析，KEGG通路展示（作图工具-KEGG 通路做图-pathview），网络分析，同时也可结合临床生存数据做预后分析（作图工具-生存曲线分析）,见图5.

图 5. 后续分析模块

图6是KEGG pathview的示例结果，差异表达的基因用高亮的颜色标注，红色高表达，绿色低表达。清晰的展示了差异基因在通路中的分布，以及差异表达情况。

图 6. pathview结果

图7是PPI分析结果的一个例子，给出了网络图，以及边的边的列表。如果用户想自己展示，调整网络，可以表达边的列表输入cytoscape中。

图7. PPI 网络构建

经过上面的几个步骤，我们就完成了RNA-Seq的基本分析流程。整个过程，我们需要做的只是输入文件，设置参数，点击保存、运行。So easy,老板再也不用担心我做不了RNA-seq 数据分析了。

参考文献

1.Huber-Keener K J, Liu X, Wang Z, et al. Differential gene expression in tamoxifen-resistant

breast cancer cells revealed by a new analytical model of RNA-Seq data[J]. PLoS One, 2012, 7(7): e41333.

2.Beane J, Vick J, Schembri F, et al. Characterizing the impact of smoking and lung cancer on

the airway transcriptome using RNA-Seq[J]. Cancer prevention research, 2011, 4(6):

803-817.