大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
、试剂
Poly-L-lysine (Sigma,P2636)
DMEM (Invitrogen,11995-065)
二、器械
手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪
x1
3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)
南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01
1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)
4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)
5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)
6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )
7) dd H 2O
8) 75％酒精
1) 2) 100 ml 小烧杯
3) 200 目不锈钢筛
4) 细胞计数器（求精）
5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)
6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)
7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）
8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)
9)
10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B
11) 注射器：50ml、5ml 各1
12) Pipette and pipette tips
13) 冰袋、手套、口罩
Day 1
1、消毒
1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。

1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、包被培养板
2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。

2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。

2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。

25ml培养瓶：3ml ；75ml培养瓶: 8m l 。

过夜。

3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEM with 10% FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。

3.2 0.125％胰酶
取0.25%Trypsin-EDTA用DPBS稀释 2 倍。

将配置好的培养基、消化酶放入4°冰箱中，待第二天使用。

4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30 分钟。

Day 2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。

2、洗板
用ddH20洗涤3 x 5 min,放入培养箱中晾干。

3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行）
3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml 烧杯中用75%酒精浸泡5min。

3.2 戴手套,用酒精棉球擦拭操作台、移液枪,点燃酒精灯。

3.3取2个培养皿，内乘HBSS放置在冰袋上。

3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。

3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将
所有的新生鼠都同样处
理）。

3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入
另一新的内乘HBSS的培养皿
中。

3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织，约1mm3。

4、接种细胞
4.1用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。

4.2每支离心管加入3 ml 0.125%胰酶，摇匀，37C消化15分钟（为增加接触面积消化更充
分可将离心管平放，也可以用60 mm 培养皿消化。

）
4.3 消化期间整理操作
台。

4.4消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10% FBS/DMEM终止消化。

4.5吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。

F面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10% FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。

一共这样分次吹打3次。

3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。

（ 吹打时候要注意，切 忌过快，要缓慢吹打。

吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。

）
弃上清，沉淀的细胞加10% FBS/DMEM3ml 重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细 胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。

4.10用细胞计数板计数：细胞浓度 =（4个大格细胞总数/4） X 41Z0il 4.11调浓度，接种。

接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经
元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。

要左右平行翻转角度，然后前后 平行翻转角度）。

具体细胞接种数值:
5、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外 线灯消毒30分钟。

6、换液
细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换液。

注意：换 液前要将10%FBS/DMEM 放入 37C 细胞培养箱中预热半小时。

7、传代
7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的 90%左右时，在37C 恒温摇床200g/min 震荡 12-14 小时，全量换液。

4.6 过筛网至60 mm 培养皿中。

4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml 离心管中。

4.8 离心：800g/min,5min 。

4.9
7.2震荡过后，弃培养基，DPBS洗涤2-3次，加入适量0.25%夷酶，37E消化1-3min （以镜下看到细胞突触回缩为最佳）。

7.3加入2ml 培养基中和胰酶，用移液管轻轻吹打细胞壁，使贴壁细胞脱落。

7.4将培养基移入15ml离心管中，200g/min离心5min,弃上清。

7.5加入新的培养基，吹打100次，使细胞散开。

7.6将细胞移入培养皿中，孵箱培养10-15min 后，将皿中培养液移至新的培养瓶中（不用包被）。

7.7每天观察细胞生长状态，每3天半量换液，待细胞爬满培养瓶的90%左右，可继续传代或
消化后将细胞接种在爬片中，进行下一步实验。