第三章细胞生物学研究方法

装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反 馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 特点：（ 1 ）可对晶体或非晶体成像，无需复 杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为 0.1 ～ 0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2 ）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚 度信息； （3 ）可在真空、大气、液体等多种条件下工作； 非破坏性测量。
形态观察
电子显微镜
透射式电子显微镜 扫描式电子显微镜 扫描隧道电子显微镜 冰冻蚀刻技术
一、光学显微镜技术（light microscopy)
(一)普通复式光学显微镜技术
(二)相差显微镜（phase-contrast
(二)微分干涉显微镜
microscope）
（differential interference contrast microscope, DIC）
(二)录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
(三)荧光显微镜技术（Fluorescence
Microscopy）
(四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）
(五)荧光共振能量转移技术(36)
(六)荧光漂白恢复技术
(一)普通复式光学显微镜
通常以锇酸和戊二醛
固定样品，以环氧树
超 薄 切 片
脂包埋，以热膨胀或 螺旋推进的方式推进 样品切片，切片厚度 20~50nm，切片采用 重金属盐染色，以增 大反差。
超薄切片机
电 镜 观 察 的 样 本 制 备
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负染就是用重金属盐（如磷钨
酸、醋酸双氧铀）对铺展在载
网上的样品进行染色；吸去染
料，样品干燥后，样品凹陷处
术（超薄切片、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术）
的原理及应用方面以简答题形式为主。
考点分析

细胞内各种化学成分的定性、定位和定 量分析技术、细胞化学与组织化学法、 免疫细胞化学法、各种分光光度术、放 射自显影和分子杂交技术等，考查的形
式多以实验设计为主进行考查。
目录

第一节 细胞形态结构的观察方法
暗视野显微镜
这种显微镜使照明光线不 能直接进入物镜，只允许被 标本反射和衍射的光线进入 物镜。 倒置显微镜：物镜和聚光镜的 工作距离较长，可以直接研 究观察备检物结构，观察培 养物细胞形态特征，细胞分 裂分化等。
二、电子显微镜

（一）电子显微镜的基本知识 （二）主要电镜制样技术
上一页
（一）电子显微镜的基本知识
3.普通光镜的应用优缺点

优点：操作简便、样品制备简便、成本低 缺点：分辨率较低，图像反差小
应用：应用领域极为广泛，主要用于观察
被检物的细微结构。
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(二)相差显微镜(PCM)

1.原理:光线通过样品时，产生直射光和衍射光， 相差板使两种光的光程差(相位差)[肉眼不可识别
]增加，通过透镜后，二者互相干涉，所形成的
合成光与背景光[直射光]的振幅差表现为肉眼可
见的明暗反差。总之，相差显微镜把光线通过样
品后形成的相位差(光程差)转化为振幅差(明暗图
像)
2.应用

广泛应用于医学、生物学尤其细胞生物学。 优点：观察活体细胞，并且不需染色
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（二）微分干涉显微镜(DIC)

1.原理 平面偏振光经棱镜折射后分成两束，在不同 时间经过样品相邻部位后，再经另外一个棱 镜使两束光汇合，从而把样品厚度上的微小
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快速 冷冻 深度 蚀刻
返回
电镜三维重构
返回i
5.扫描电镜
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，
探测器收集二次电子成象。
它是将标本表面上发射出的 次级电子 ( 二次电子 ) ，
被探测器 ( 带样电荷的栅极 ) 收集后，即向 电子显象
管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫
描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实

(3)光路系统 由光源、滤色系统、集光镜、反光镜、物镜和 目镜等组成
3.应用

目前对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具。 荧光显微镜技术包括:

荧光素直接标记技术和间接免疫荧光标记技术
优点：图像清晰，灵敏度高，细胞内物质可做特异性观察与 分析
不同荧光染料
标记
抗体
特异性结合
抗原
(细胞的蛋白质成分) 分裂细胞的 免疫荧光图 像
第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物
第一节 细胞形态结构的观察方法

本节主要内容：
一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术
三、扫描隧道显微镜
细胞形态结构的观察方法
暗视野显微镜
普通光镜 光学显微镜 特殊光镜
相差显微镜
微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜
通过物镜和目镜放大成
质发出可见荧光， 像， 观察和摄像
荧光显微镜的成像原理
3阻断滤光片
2分色镜[二相色镜]
1激发滤光片
2.结构性能

(1)荧光光源---------高压汞灯、氙灯 (2)滤色系统
a.激发滤光片----选择激发光的波长
b.阻断滤光片----吸收或阻挡激发光进入目镜， 防止成像干扰和保护眼睛
（4）可连续成像，进行动态观察。
用途：纳米生物学研究领域中的重要工
具 , 在原子水平上揭示样本表面的结构 , 直接观察生物大分子，如 DNA 、 RNA和 蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物
结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
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差别转化为明暗区别。
2.应用

观察活细胞中较大的细胞器。 DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强， 适合于显微操作。目前像基因注入、核移植 等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进
行。
普通显微镜
相差显微镜
DIC显微镜
暗视野显微镜
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(二)录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy）

430
2．原理
490
430
530
（六）荧光漂白恢复技术
( fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)

1．原理：见p56

2 ． 应用 ： FARP可以用于解决活细胞内包括蛋白质定
位、动力学以及其他成分相互作用等问题。
其他光学显微镜
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨 率下研究活细胞中的颗粒及细胞器 的运动。
录像增差显微镜中的颗粒及细胞器的运动
中的颗粒及细胞器的运动
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(三)荧光显微镜技术
1.技术原理 2.结构性能 3.应用
1.技术原理

强光源发出紫外光和蓝紫光，
经过滤光系
统，
照射到样品，
激发样品中的荧光物
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(四)激光扫描共焦显微镜技术
(Laser Scanning Confocal Microscopy、LCM)

1.原理：激光源经过双色镜反射，经物镜后汇聚到样 品(预先经免疫荧光标记)的某一焦点，从焦点发出的 荧光经过透镜汇聚成像并被检测器检出,而非焦点区
的荧光不能汇聚成像。
逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与
铺了一薄层重金属盐，而凸出
的地方则没有染料沉积，从而
出现负染效果
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3、冰冻蚀刻（freeze-etching）

亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。步骤如下：

(1)标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进
行冰冻。


(2)然后用冷刀骤然将标本断开，
(3)升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面 结构，称为蚀刻（etching）。
（二）主要电镜制样技术
1. 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图
2.负染色技术（Negative staining）与金属投影
染色背景，衬托出样品的精细结构 3.冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图）
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗 粒和膜表面结构。

1. 普通复式光学显微镜组成
2. 普通光镜的成像原理
3. 普通光镜的应用优缺点
第一节 细胞形态结构 的观察方法 目镜
物镜
载物台 集光器 光源
1.普通复式光学显微镜组成
目镜
光学放大系统
物镜
光源
照明系统
折光镜
聚光镜 镜臂
机械和 支架系统
底座
载物台 其他(镜筒、物镜转换器、调焦装置)
2. 普通光镜的成像原理
B.对固相、液相物体均可进行观察
牛肺动脉的内 皮细胞
Mitose - Tubulin (FITC), DNA (PJ) 返回
（五）荧光共振能量转移技术
（fluorescence resonance energy transfer, FERT)

1．应用
该技术是检测活体中生物大分子纳
米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用 于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直 接的相互作用。
快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 4.电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。
电镜三维重构技术与 X- 射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结 合，是当前结构生物学（ Structural Biology ） ——主要研究生物
荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的
聚焦点，也是瞬时成像的物点。
激光扫描共焦显微镜原理图

2.应用：观察亚细胞结构如内质网膜系统和
细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。
3.优点：A.通过共聚焦可进行“光学切片”，
观察较厚样品内部结构，排除焦平面以外光的干 扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)， 获得样品三维结构；

判断题：在使用光学显微镜时，如果物镜不变，用10倍的目
镜时的分辨率比用5倍的目镜高1倍。

（×） 比较放大率和分辨率的含义。 总结:物镜已经分辨清楚地细微结构，假如没有经过目镜的 再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚。但物 镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也 还是看不清楚。所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜 的分辨率。

(4)蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，
再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。-
--(复型)

(5)然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂
的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复
膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到
的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
冰 冻 蚀 刻
冰冻 蚀刻 电镜 照片
结构。
扫 描 电 镜
第 一 节 形 态 观 察 技 术
三、 扫描遂道显微镜
Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离 (100nm) 时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的 隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、 摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样 品表面形貌信息、电特性或磁特性等。
1.电镜与光镜的比较
2.电镜与光镜光路图比较 3.电子显微镜的基本构造
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1.电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM 200nm 可见光 （400-700） 紫外光 （约 200nm) 电子束 （0.01-0.9） 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
图像
物镜
样品

聚光器
光线
光学显微镜的光路图
D: 分辨率(指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能区分开 两个质点之间的距离)； ：光源波长 ：物镜镜口角(标本在光轴的一点对物镜镜口的张角) N: 介质的折射率
计算可知，介质为空气时 N=1, D0.3m;
介质为香柏油时 N=1.5, D0.2m 普通光镜的最大分辨率为0.2 m=200nm
100nm
玻璃透镜
不要求真空
TEM
0.1nm
电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差
2. 电镜 与光 镜光 路图 比较
3. 电子 显微 镜的 基本 构造
电镜优点

分辨率高，成像清晰；透射电镜观察细
胞内部亚显微结构，扫描电镜观察下表 面结构生成三维立体图像。
第三章 细胞生物学研究方法

本章主要介绍细胞形态结构的观察方法、细胞
组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方 面的技术与研究。
考点分析

本章主要考查各类方法技术的原理及用途,考查形式
多样。

光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素,各种
特殊显微镜的基本特点及应用范围.

电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技