克伦特罗残留检测试剂盒条件的优化及其应用

表 K 稀 释 液 LM 值 的 影 响 "#$%&’(值 ) *+,-K N55/12456308234’LM 4’NOP.Q R/S802S
标准品含量 VWXYZ[\A
D
D-A
D-G
A-D
G-D
A-EAD D-IGI D-CGF
稀释液
=>?@<= 9:;
9:;<= =:;<=
表 ! 抗 体 稀 释 液 的 选 择 "#$%&’(值 ) *+,-! ./0/1234’45(4’4104’+0+’23,4676308234’ 9:; 9:;<= =:; =:;<= =>?@ =>?@<= 生理盐水
A-BCD A-EJJ D-IBD D-CJH
试验动物为 4月龄的健康猪 AK头@A07号猪作为阴性对照&4kAC号猪用添加盐酸克伦特罗的饲 料进行饲喂@给药剂量为 F)B#GH#IA@连续饲喂 Ml@分别于停药后第 A070M0(0AC天采集尿样@将 尿 样 F))YG$".IA离心 F$".@取上清@进行间接竞争 <=>!? 反应8
; 结果与分析
A-EFE A-HCA D-IEC D-CFI
A-GFH A-BHA D-IEH D-CJA
A-BCA A-AFC D-IEE D-CIF
A-IIF A-BBA D-IIG D-CBI
A-CCJ A-GHH D-IIA D-CBA
A-GED A-HEA D-IEC D-IBD
TU 值
J-H F-B C-D
由 表 B可 计 算 出‘当 标 准 品 含 量为 AWXYZ[\A时‘方法 A的抑制 率 为 HA-He‘方法 H为 HJ-Ie‘方 法 E为 EA-Ae‘可见方法 E所产生 的抑制率明显高于其他两种方法‘ 但考虑到实际操作‘方法 H较实用‘ 且 时 间 短_速 度 快‘当 标 准 品 为 AWXYZ[\A时 抑 制 率 在 同 等 条 件 下也达到 HJ-Ied !-f 间接竞争 NOP.Q标准程序的 确定
F 材料与方法
F4F 试剂盒相关试剂 包被抗原#*+,-./(B抗 *+单克隆抗体均为本室自制C%D@盐酸克伦特罗BGHI标记羊抗鼠 17J为
收稿日期)$&&C &B $& 基金项目)江苏省畜禽产品安全性研究重点实验室开放课题 #$&&B &$( 作者简介)邵红霞#:’5A9 (!女!江苏海安人!扬州大学助教B硕士!主要从事畜禽病原微生物及免疫学研究3 " 联系作者!0,>!&5)!&K&!=L4"%4./%41=
第 $5卷第 $期
扬 州 大 学 学 报 #农 业 与 生 命 科 学 版 (
.$54$5M$4$
$&&C年 C月
N$%0=!5$8~!=7"#$%O=&3.0-&+4#/70&1%5+%0!5!=/+&8.21&.=1.0/&+&$=(
N%=4$&&C
PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
表 9 抗 md单抗与包被抗原最佳浓度的筛选结果 nop:9 qrsbtouavwaxwsyosbvwvz
;:9 抗原最佳包被浓度及单抗稀释度的选择 按上述方法方阵滴 定结 果见表 A8由 表 A可
知@当 SCT).$值接近 A:)时@包被抗原的工作 浓 度 为 AVF)))@由包被的抗原浓度可推算出包被的 蛋 白 质 量 为 ):M7B#G 孔IA@单 抗 可 作 AV 7)))
稀 释 液 虽 然 反 应 性 好@SCT).$值 高@但 不 同 介 质 溶 液 对 其 有 较 大 的 影 响@因 此 选 定 2E!’+ 为 单 抗 稀
释液8
GD
扬 州 大 学 学 报 "农 业 与 生 命 科 学 版 )
第 HJ卷
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
将 包 被 抗 原 以 碳 酸 盐 包 被 液 稀 释 成 一 定 的 浓 度@每 孔 A))B=@CD过 夜&2E!+ 洗 涤 A次&以 F)#GH#IA脱脂奶 粉 满 孔 封 闭JKL@4MD水 浴 作 用 7N&2E!+洗 涤 4次@将 单 抗 与 检 测 样 品 依 次 加 入 到 包 被好的 <=>!? 板上@4MD水浴作用 CF$".&2E!+洗涤后加入工作浓度的 6O2标记羊抗鼠 >#P@每 孔 A))B=@4MD水浴作用 CF$".&经 2E!+洗涤 F次@加入新鲜配置的邻苯二胺*123/底物溶液@每孔 A))B=@4MD水 浴 作 用 7)$".&加 入 7$QRG =IA浓 硫 酸 终 止 显 色 反 应@用 酶 联 免 疫 阅 读 仪 测 定 其 SCT).$值 8 9:U 抗原最佳包被浓度及单抗稀释度的确定
分 别 用 ):)F$QRG=IA0X6 M:70K:C0(:)的 +Y"Z’+02E!02E!’+0+E!’+作 为 稀 释 液@对 单 抗 和 标 准样品稀释@进行 <=>!? 检测@测定 SCT).$值8 9:[ 样品与单抗加入次序及作用时间的确定
按 上 述 程 序@在 加 入 单 抗 与 样 品 时@分 别 采 用 如 下 方 法\] 标 准 品 与 单 抗 同 时 加 入 <=>!? 板@ 4MD 作用 K)$".&^ 标准品与单抗同时加入 <=>!? 板@4MD作用 4)$".&_ 标准品与单抗等量预先 4MD作用 4)$".@然后再加入到 <=>!? 板@4MD作用 CF$".8测定 <=>!? 的 SCT).$值8 9:‘ abcdefg标准曲线的建立
i=’1!? 稀释度
AV 7))) AV 4))) AV C)))
md{|agpow}avosowsb~xw 不 同 抗 i=单 抗 稀 释 度 的 SCT).$值
AV A)))
AV 7)))
AV 4)))
A:MFM A:C(F A:47C
A:KMM A:4(K A:7CC
A:F7F A:7F4 A:AA7
克 伦 特 罗 #*+(又 称 ?瘦 肉 精@!是 一 种 人 工 合 成 的 A$,肾 上 腺 素 受 体 激 动 剂!具 有 扩 张 支 气 管 平 滑 肌的作用!常用于防治哮喘B肺气肿等肺部疾病3当其使用剂量达到治疗量的 %?:&倍时!具有能量分配 作 用 !可 使 机 体 肌 肉 合 成 增 加 !脂 肪 沉 积 减 少 C:D3但 同 时 造 成 动 物 性 食 品 中 ?瘦 肉 精 @的 残 留 !从 而 引 起 人 类中毒事件的发生C$,ED3因此!各国政府都禁止用 *+作为肉用动物的饲料添加剂3我国政府也禁止在饲 料 中添加 *+!而且制订了 *+的最高残留标准CBD3为了使 *+快速检测试剂盒能应用于生产实践!本研 究 在 已 研 制 的 抗 *+单 克 隆 抗 体 的 C%D 基 础 上!建 立 了 快 速 检 测 *+的 间 接 竞 争 0+12/ 试 剂 盒!该 方 法 最小检测量为 &4$%=78>+9:!并可应用于临床样品的监测3
!-K 稀释液 LM 值的影响 分别调单抗及二抗的稀释液的
TU 值 为 J-H_F-B和 C-D‘进 行 a[b;c 测定d结果表明当稀释液的 TU 为 J-H时结果相对稳定‘TU 为 F-B_C-D时 产生的抑制 曲线 不规则 "表 E)d !-$ 样 品 与 单 抗 加 入 次 序 及 作 用 时间的确定
将包被抗原以包被缓冲液作 AV7)))0AV4)))0AVC)))0AVF)))0AVK)))稀释@每一稀释度加 一横列@每孔 A))B=@4MD温浴或 CD过夜@将单抗以 AVA)))0AV7)))0AV4)))稀释@每一稀 释度 加一竖排@每孔 A))B=@进行方阵 <=>!? 测定@确定包被抗原及单抗最佳工作浓度8 9:W 稀释液的选择
[\]D \KLV^ZGJ!_‘a ]G^bGJL!c]ad \KLV^MPG
#efghijklmniopqrstfuvfwxfy!ziop{|kr}onu!~!=7"#$%!$$%&&’!*#&=!(
]’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cD)>[)15.=,%+.0$5@1&0+12/@.-+!,5&-#
关键词)克伦特罗@间接竞争 0+12/@试剂盒
中 图 分 类 号 )2A%’4AB
文 献 标 识 码 )/
Leabharlann Baidu
文章编号):C5: BC%$#$&&C(&$ &&BA &B
DEFGHGIJFGKLKMNOPLQRFPSKOTPFPNFGKLUGFJLTHKLGFKSGLV HPFJQKOGWH KMXYMSKH PZEPSGHPLFWJHEOPW
按 上 述 方 法 获 得 最 佳 的 抗 原 包 被 浓 度0包 被 条 件0抗 体 稀 释 倍 数 和 封 闭 剂 等 条 件 进 行 间 接 竞 争 <=>!? 试验@制备标准曲线8 9:h 回收率的测定
用已知浓度的 i=添加到猪的阴性尿液中@根据标准曲线计算其含量@计算回收率8 9:j 样品的测定
第 7期
邵 红 霞 等 \克 伦 特 罗 残 留 检 测 试 剂 盒 条 件 的 优 化 及 其 应 用
CT
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
美国 !"#$%产品&吐温’()*+,--.’()/0邻苯二胺*123/04)5 6717购自 上 海 桃 浦 化 工 厂&其 他 有 关 试 剂均为国产分析纯试剂8 9:; 间接竞争 <=>!? 方法的基本程序
克伦特罗残留检测试剂盒条件的优化及其应用
邵红霞!秦爱建"!王宏飞
#扬州大学 江苏省动物预防医学重点实验室!江苏 扬州!$$%&&’(
摘 要)以 *+,-./ 为包被抗原!抗克伦特罗单克隆抗体为一抗!组建检测克伦特罗的竞争 0+12/ 试剂盒3以方阵滴定 确 定 包 被 抗 原 最 佳 浓 度 #&45$678 孔9:(!抗 克 伦 特 罗 单 克 隆 抗 体 #$;:$(最 佳 稀 释 度 #:< $&&&(!并 建 立 0+12/ 标 准 曲 线!确定最小检测量为 &4$%=78>+9:3用该方法检测动物模型仔猪尿样中的盐酸克伦 特 罗!结 果 表 明)停 药 后 第 :? 5 天尿样均为阳性!$周后有少量猪仍为阳性!而阴性对照猪尿样均为阴性3这表明建立的试剂盒对克伦特罗残 留 的 检 测 具有广阔的应用前景3
稀释8 ;:; 单抗稀释液的选择
AV F))) AV K)))
A:A(K ):T((
A:)FA ):(FF
):TK) ):(A4
试 验 结 果 *表 7/表 明@不 同 的 稀 释 液 稀 释 单
抗对检测结果有一定的影响@将阴性样品与以不同稀释液稀释的单抗等体积混合后加入 <=>!? 检测板
中@结果发现以 2E!’+稀释 单抗@阴 性 样品 间 差 异最 小@反应 性也较 +E!’+好@而 +Y"Z’+和 2E!两 种