钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的研究进展

读书报告钙蛋白酶抑制蛋白研究进展汪超钟正泽杨飞云周晓蓉曹兰（重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460）摘要：钙蛋白酶在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度，钙蛋白酶抑制蛋白是在细胞内广泛表达的、高效的、专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质，因此引起了广大研究者的广泛关注。

本文阐述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构，生物学作用，营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其活性测定方法。

关键词：钙蛋白酶抑制蛋白结构生物学作用活性测定Research Progress of CalpastatinW ang chao, Zhong zhengzhe, Y ang feiyun, Zhou xiaorong ,Cao lan (Chongqing Academy of Animal Science,Rongchong 402460 ) Abstact: Calpain make a contribution to Meat Tenderization by degradation of protein in the postmortem meat tenderization process. Calpastatin , a special endogenous inhibitor expressed extensively in cell , has a special inhibition to calpain. Therefore ,This paper review the structure ,biologic function, influenced factors , separation and activity assay of calpastatin.Key words: Calpastatin. Structure , Biologic function, influenced factors , activity assay钙蛋白酶(Calpain)是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶，分布于所有脊椎动物的肌细胞内部。

钙蛋白酶家族包括μ-钙蛋白酶,m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。

钙蛋白酶在骨骼肌中通过涉及生肌细胞分化、激发肌原纤维蛋白周转来调控生长，同时在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度。

钙蛋白酶被钙离子和钙蛋白酶抑制蛋白调控[1]。

钙蛋白酶抑制蛋白是一种有着多种功能的内源抑制剂，它通过抑制钙蛋白酶而发挥作用。

本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、生物学作用、营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其分离与活性检测方法等。

1 钙蛋白酶抑制蛋白的结构肌肉组织中钙蛋白酶抑制蛋白的分子量为77 KDa，斯托克半径为6.8nm，含有少量的α‐螺旋，以随机的卷曲结构存在。

钙蛋白酶抑制蛋白是由一条多肽链组成的蛋白，它含有5个结构域(图1)，不同哺乳动物钙蛋白酶抑制蛋白的cDNA 序列的保守性较差。

第一个结构域即L结构域的功能还不太清楚，此结构域在某些细胞的钙蛋白酶抑制蛋白中不存在，如红血球中的钙蛋白酶抑制蛋白。

第二到第五个结构域是四个结构相似的重复单位，每个重复单位的氨基酸残基具20％～35％同源性。

每个重复单位含有三个保守区，分别为A、B、C。

保守区B约含30个氨基酸，其中由Thr-Ile—Pro-Pro-X—Tyr-Arg组成的七肽序列十分保守，X代表不同的氨基酸，因此它可能是钙蛋白酶抑制蛋白起抑制作用的关键部位。

通过基因重组，使钙蛋白酶抑制蛋白 cDNA片段在大肠杆菌中表达。

发现含此保守序列的多肽片段，即使少到30～70个氨基酸残基，也能抑制钙蛋白酶的活性。

Maki 等发现人工合成的含TIPPXYR的23个氨基酸残基或更长的短肽可以抑制钙蛋白酶活性。

保守区A和C决定着钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶中CaM类似结构域的结合。

通过定点突变实验发现当保守区A和C中Lea-161和Lea-236被Pro替代时，钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶的亲和力将大大降低。

如果删除保守区B，钙蛋白酶抑制蛋白虽然失去了抑制活性，但仍可有效地与钙蛋白酶中CaM类似结构域结合，此实验有效地证实了重复序列中三个保守区所行使的功能。

另外，钙蛋白酶抑制蛋白还有多个同功型分布于心肌及其它组织[2]。

图1 钙蛋白酶抑制蛋白结构示意图2.钙蛋白酶抑制蛋白的生物学作用在宰后肉类成熟过程中，μ-钙蛋白酶通过降解α-肌动素，Z-nin蛋白 , m-钙蛋白酶通过在宰后降解肌间线蛋白，联结蛋白，半肌动蛋白，肌钙蛋白T和I，原肌球蛋白， C-蛋白和M-蛋白来弱化肌纤维结构，从而提高肌肉嫩度。

通常蛋白酶如果过度激活的话，其在生物学体系中将是一种潜在而剧烈的破坏物。

因此它们通常由特异性和非特异性抑制剂严格控制。

而钙蛋白酶的活性也同样被其抑制剂钙蛋白酶抑制蛋白调控。

钙蛋白酶抑制蛋白是在细胞内广泛表达的、高效的、专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。

当钙蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化并与之特异结合[3], 从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。

由于钙蛋白酶在自溶后才表现活性，因此钙蛋白酶抑制蛋白被认为是岳阳家政通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用的，且这种抑制作用并不受pH的影响。

钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶的结合需要Ca2+，并且这种结合是可逆的，即在无Ca2+时重新分离。

在大多数组织中，其钙蛋白酶抑制蛋白浓度足以抑制钙蛋白酶活性[4]。

另外，降解后的钙蛋白酶抑制蛋白同样具有抑制钙蛋白酶活性的作用[5][6]。

钙蛋白酶抑制蛋白的第Ⅱ到第V结构域中的A和C保守区，与钙蛋白酶的Ⅳ和Ⅵ结构域紧密结合，然后B保守区钙蛋白酶的Ⅱ结构域结合而发挥抑制钙蛋白酶的作用[7]。

因为钙蛋白酶在宰后肉类嫩化过程中起基础作用，因此钙蛋白酶抑制蛋白与肉的嫩度也有着密切关系。

当活体肌肉中蛋白质降解减弱时，钙蛋白酶抑制蛋白活性增加[8][9]。

钙蛋白酶抑制蛋白活性同肉的宰后嫩化成反比，它在能引起牛肉的嫩度变化（～40%）的措施中起着比其他单一措施更重要的作用[10][11]。

在转基因鼠上的研究表明，高水平有活性的钙蛋白酶抑制蛋白表达将直接导致宰后蛋白质溶解下降, 但这种活性仅在宰后对细胞关键骨架蛋白质的降解起作用[12]。

宰后钙蛋白酶抑制蛋白活性与牛羊肉嫩度有着密切关系，其相关系数分别为0.66和0.64，因为高钙蛋白酶抑制蛋白活性可抑制钙蛋白酶活性，因而降低了肉的嫩度[13]。

，另有研究表明，在钙蛋白酶系统中与嫩度最高度相关的就是钙蛋白酶抑制蛋白与μ-钙蛋白酶的活性的比值[14]。

Delgado等（2001）研究表明，牛羊宰后嫩化同宰后钙蛋白酶抑制蛋白降解率有关[6]。

3营养及其他因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响研究表明，毛孔大怎么办营养及其它因素可以调控钙蛋白酶抑制蛋白的量及其活性。

Du（2004）等通过对怀孕30天的母牛及其牛犊研究发现,在维持净能为对照组的68.1%,维生素和矿物质为需要量一半的的情况下,对照组母牛比实验组母牛肌肉中有更高含量的钙蛋白酶抑制蛋白(P<0.05)。

而与之相反, 对照组母牛所产牛犊肌肉中的钙蛋白酶抑制蛋白含量较实验组牛犊低((P<0.05)[15]。

Helman(2003)研究表明，饲喂高鸡蛋白（28%）日粮的狗比饲喂低谷蛋白（12%）的狗肌肉中的钙蛋白酶抑制蛋白的表达量要高许多((P<0.05)，同时发现饲喂高鸡蛋白的狗比饲喂低谷蛋白的狗在调节由钙蛋白酶所介导的蛋白质降解方面有更大的潜力[16]。

Kendall(1993)研究认为,在体外随着离子强度的增大,钙蛋白酶抑制蛋白的活性有所下降,但在有肌纤维存在的情况下,宰后肌肉中典型的离子强度并不影响钙蛋白酶抑制蛋白的活性[17]。

Kretchmar (1990)研究发现,在育肥羊上饲喂 4 ppm 的β-兴奋剂L-644, 969将大幅提高钙蛋白酶抑制蛋白的活性[18]。

Duckett (2000)报道, callipyge 型羊肌肉中的钙蛋白酶抑制蛋白的活性高于正常羊[19]。

4 钙蛋白酶抑制蛋白活性检测4.1 钙蛋白酶抑制蛋白的分离[6]图2 钙蛋白酶抑制蛋白的分离的技术路线取25g肌肉，怎么减肚子剔除脂肪和结缔组织，切成小块，放入组织捣碎机中，加入3体积的抽提液（100ml Tris-HCl,pH=8.3; 10m M EDTA；10 mM 2-巯基乙醇及6 mg亮肽素(Leupeptin)/L，100mg 卵类粘蛋白(Ovomucoid)/L,和2 mM 苯甲磺酰氟）捣碎匀浆。

每匀浆30秒钟后，冷却30秒再进行下次匀浆。

共3次。

匀浆液在37500×gmax条件下离心120分钟，取上清液并记录其体积。

将上清液置于25倍体积的透析液（40m M Tris-HCl; pH=7.35; 5m M EDTA;10 m M MCE）中透析过夜，然后进行离子交换层析。

层析柱规格为1.6×20cm DEAE-Sephacel 柱,流速为30ml/h。

先用约5倍柱体积平衡缓冲液（50 m M Tris-HCl; pH7.5；0.5m M EDTA；10 m M MCE；4ºC）洗脱至A278（278nm波长下的吸光度值）达到基线，再用25到105 m M梯度NaCl缓冲液（50 m M Tris-HCl; pH7.5；0.5m M EDTA；10 m M MCE；4ºC）洗脱，收集分样即为钙蛋白酶抑制蛋白。

4.2 钙蛋白酶抑制蛋白的活性测定[20]1单位钙蛋白酶抑制蛋白活性被定义为抑制1单位的m –钙蛋白酶活性所需的钙蛋白酶抑制蛋白的量痔疮偏方。

因此，测定钙蛋白酶抑制蛋白活性需要部分纯化的m –钙蛋白酶。

但测定钙蛋白酶抑制蛋白活性宜用新鲜样品（宰后45分钟内），不宜用冷冻肉样。

钙蛋白酶抑制蛋白活性测定需要做以下3管活性。

a管只含m-钙蛋白酶，b管含m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白收集液。

C管含钙蛋白酶抑制蛋白收集液，但其反应混合液不含CaCl2。

具体方法是：取适当体积的各组分收集液在 4ºC温育1min后，加入1.5ml含反应混合液（100ml Tris-HCl,10 m M MCE，5mg/ml 酪蛋白和5 m M CaCl2，用1N的乙酸调节到PH为7.5）中，在25ºC条件下反应60分钟。

用浓度为5%的三氯乙酸终止反应和沉淀未降解的酪蛋白。

将反应混合液在2000×g max离心30分钟，取上清液在波长为278nm下测定并记录其吸光度。

钙蛋白酶抑制蛋白活性根据下列公式计算：钙蛋白酶抑制蛋白活性=a-(b-c) ×稀释倍数。