微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色

二、实验原理---简单染色 实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀 死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其 对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定 两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形 两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。 固定时尽量维持细胞原有的形。
三、实验器材
1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面 菌种。 2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接 种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。 3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶 95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶 （香柏油和二甲苯）。
四、实验方法和步骤
双层瓶
香柏油
二甲苯
下一个实验
实验三、学校公共环境微生物的分离与纯化
二、实验原理---革兰氏染色 实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌 G+）和 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和 革兰氏阳性菌（ 革兰氏阴性菌（ 革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法 是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性 和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结 构和组成不同决定的。
附Leabharlann Baidu油镜的使用
双目显微镜
单目显微镜
2.油镜的原理 2.油镜的原理
油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时， 油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时， 因介质折光率不同，光线将发生散射现象， 因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜 筒的光线很少，物象不清。 筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加 入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至 入与玻璃折射率相近的香柏油， 因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。 因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。
二、实验原理---革兰氏染色 实验原理---革兰氏染色
当用结晶紫初染 当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染 结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染 成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成 结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰 两类细菌的脱色效果是不同的。革兰 氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成， 壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮) 壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低， 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其 细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞 碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞 被染上复染剂的红色。。
2. 革兰氏染色
1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4 ）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4 处下面用记号笔分别标明S 处下面用记号笔分别标明S和E（见图示），并 滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌涂布在相应的区域内。
2. 革兰氏染色
2、干燥与固定：方法同（一）中2，3 、干燥与固定：方法同（一）中2 步骤 3、染色： 结晶紫染色1 分钟--水洗--碘液 结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液 媒染1 分钟--水洗--酒精脱色15媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20 秒--水洗--番红复染色2-3分钟--水洗 --水洗--番红复染色2 分钟--水洗 --干燥--镜检记录。 --干燥--镜检记录。
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数× 显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这一 步？ 2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
细菌的简单染色 1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸 涂片： 1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸 馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充 分混匀涂成薄膜。 干燥： 2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 固定：涂面朝上，通过微火2 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 染色：待玻片泠却后加结晶紫1 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂 面染色1 面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的 水洗： 水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 干燥： 镜检： 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---革兰氏染色 实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结 晶紫进行初染，再用碘液媒染 碘液媒染，然后用乙醇 晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇 或丙酮)脱色，最后用复染剂 如番红)复染。 用复染剂( (或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的 蓝紫色的 细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被 脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色 脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红 复染剂的颜色( 色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
四、实验步骤
1、菌落形态观察：
滴加少量水 注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、 2、细菌简单染色：
3、细菌革兰氏染色。
干燥→镜检
挑取菌体 注意事项：
颜色、边缘是否规则等特征。 染色过程： 涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→
涂片 干燥
涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥
固定 染色 水洗：水流不能直接冲在涂菌处 水洗 干燥
实验二 细菌的简单染色和 革兰氏染色
林标声
球菌
杆菌
弧菌
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的 1. 学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技 术。 2. 了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。
二、实验原理---简单染色 实验原理---简单染色
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别， 必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使 经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地 观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形 观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形 状和细菌排列的观察。 状和细菌排列的观察。 常用碱性染料 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱 碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离 细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离 时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部 分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与 背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简 单染色的染料有美蓝 结晶紫、碱性复红等。当细菌分解 单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解 美蓝、 糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时 糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时 可用伊红 酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 伊红、