食品中叶酸的测定方法
RRLC(高分离度快速液相色谱)法测定孕钙片中叶酸的含量
RRLC(高分离度快速液相色谱)法测定孕钙片中叶酸的含量刘杰;季晓娟;葛亮;田树革【摘要】目的:采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪测定孕钙片中叶酸的含量.方法:色谱柱为Zorbax XDB-C18(4.6×50mm,1.8um),流动相:乙腈-5%甲酸(31:69),检测波长:280nm,流速:1.0mL·min-1,柱温:30℃.结果:叶酸在0.2-1.0μg·ml-1( r=0.9996)内峰面积与浓度呈良好的线性关系,加样回收率为99.28% (RSD=2.65%).结论:采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪测定孕钙片中叶酸的含量,可缩短分析时间,提高效率,降低成本.本方法简便、准确,结果稳定.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2011(020)019【总页数】2页(P51-52)【关键词】孕钙片;高分离度快速液相色谱;叶酸【作者】刘杰;季晓娟;葛亮;田树革【作者单位】新疆医科大学附属中医医院药学部,新疆,乌鲁木齐,830002;新疆医科大学第一附属医院药学部,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学中医学院,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学中医学院,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R284.1叶酸又称蝶酰谷氨酸 (PGA)［1]，是人和动物为维持正常的生理功能而必需从食物中获得供给的微量有机物质。
叶酸缺乏可致孕妇妊高征、先兆子痫、胎盘早剥的发生率增高;胎盘发育不良导致自发性流产;其中影响最大的是引起胎儿神经管畸形(NTD)［2]。
近年来，我国已在婴幼儿、老年食品中强化叶酸、乳粉中添加叶酸。
因此，建立简单、快速、准确的测定各种食物尤其是婴幼儿、孕妇强化食品中的叶酸含量的方法有重要现实意义［3]。
目前常用的检测叶酸方法有：比色法、薄层层析法、微生物法、酶联免疫法和高效液相色谱法［4－7]。
孕钙片是以碳酸钙、葡萄糖酸锌、叶酸、维生素类成分等为主要原料制成的保健食品，具有补充钙、锌及叶酸的保健功能，我们采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪对孕钙片中的叶酸含量进行测定，确定测定叶酸含量及控制的有效方法。
食品中叶酸分析方法及稳定性研究进展
食品中叶酸分析方法及稳定性研究进展作者：康文怀叶晓利李慧李巧玲秦玲来源：《河北科技大学学报》2019年第05期摘要：通过优化样品前处理体系，建立精确的叶酸分析檢测方法，对促进叶酸的多方面、深层次研究具有迫切的现实意义。
介绍了叶酸的分子结构及其主要存在形式，以及常见食品中叶酸的含量。
阐述了化学法和酶解法等样品前处理方法，分析表明在测定富含淀粉、蛋白质的豆类、谷物等食品中的叶酸时，更适合采用与淀粉酶、蛋白酶等联合使用的酶解法。
综述了微生物法、荧光分析法、液相色谱法等常见叶酸检测方法，指出高效液相色谱-质谱联用法可快速测定不同形式的叶酸，且具有高效、精确等特点。
探讨了影响叶酸稳定性的因素，以及提高叶酸摄入量和稳定性的措施，认为可通过在主粮作物中添加叶酸、蛋白质胶囊包裹叶酸、促进叶酸与蛋白质结合等方式来提高叶酸的摄入量及其稳定性。
关键词：食品检验学;叶酸;提取;农产品;稳定性中图分类号：TS210.1 文献标志码：Adoi：10.7535/hbkd.2019yx05010Advances in research on analysis methods andstability of folic acid in foodKANG Wenhuai， YE Xiaoli， LI Hui， LI Qiaoling， QIN Ling（School of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang， Hebei 050018， China）[WT5HZ][HJ2.4mm]Abstract：It is urgently and practically significant to optimize the sample pretreatment， and to establish accurate detection of folic acid content in food and the presence of folic acid， in order to promote the in-depth research of various aspects of folic acid.In the paper， the molecular structure of folic acid and its main forms， as well as the content of folic acid in common foods are introduced. The sample pretreatment methods such as chemical method and enzymatic hydrolysis method are described. It is indicated that the enzymatic hydrolysis method is more suitable for the determination of folic acid in foods such as beans and grains， so that the folic acid combined with protein， starch and the like is fully hydrolyzed by using a combination of protease and amylase. The common methods for detecting folic acid， such as microbial method，fluorescence analysis method and high performance liquid chromatography （HPLC）， are reviewed. HPLC is characterized by high efficiency and precision， especially ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， which canquickly determine different forms of folic acid. Factors affecting the stability of folic acid and measures to increase folic acid intake and stability are explored.It shows that the measures to increase folic acid intake and stability includes adding folic acid in staple crops， packaging folic acid with protein capsule， facilitating the combination of folic acid and protein， etc.Keywords：food inspection; folic acid; extraction; agricultural products; stability叶酸（folic acid，folate，FA），化学名为蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA），是蝶啶系列衍生物的总称，属于水溶性B族维生素。
【微生物检测】 关于使用微生物方法测定食品中叶酸含量的一点心得
【微生物检测】+关于使用微生物方法测定食品中叶酸含量的一点心得时光荏苒，下笔之时才猛然惊觉自己已经在微生物检测一线奋斗了6年之久，6年里从懵懂到兴奋，从兴奋到麻木，再从麻木到坦然，6年里有过厌倦，有过迷惘，但是最后都坚持了下来，虽然现在已经不在检测一线工作（还是与检验有关，但是不再进行实验），回想6年来走过的路，还是感慨良多，当初的微生物检测经验也还是宝贵的工作经验积累，这次就先谈谈微生物与维生素的关系，文笔有限，既欢迎志同道合的朋友的点赞，也欢迎各路大神大师的神级吐槽，希望我们可以一起讨论，一起进步~不知道现在的小伙伴们测试食品中的叶酸、维生素B12和游离生物素都是用什么方法呢？是比较繁琐的传统的微生物方法呢，还是比较简便快速的试剂盒法呢，估计很多小伙伴们都选用试剂盒法了，毕竟时代在进步，检测水平也在不断提升，但是就像电视机的问世并没有取代收音机一样，传统的微生物方法虽然繁琐，耗时较长，但是灵敏度高，不容易漏检，所以还是有它的优势在，所以下面我就着重的跟小伙伴们分享一下使用微生物方法（光密度法）测试食品中叶酸的过程中可能会出现的问题以及一些注意事项，希望能给大家提供一些帮助或者拓宽一下大家的检测思路。
叶酸的测定叶酸的测定一般常用的有两种方法，分别是GB5413.16-2010和GB5009.211-201 4，前者主要针对的是婴幼儿食品，尤其是婴幼儿乳制品，后者的检测对象比较宽泛，适用于多种类型的食品，比如水果蔬菜等天然食品，还有淀粉含量比较高的米粉类制品，以及叶酸含量较高的营养强化剂等，所以面对不同的样品，要选择合适的标准进行测试。
测定原理之类的标准上都有，测试之前仔细看清楚就行，这里就不再赘述了，下面就按照日常的测试流程给大家梳理一遍，里面会提及常见的问题及注意事项。
1、标准溶液的制备：标准品一定要准确称量，而且计算需要量的时候要考虑标准品含水量之类的因素，不要算错了，标准溶液是标杆，它如果出现错误，后面的每一步就都没有意义了，配置的时候记得加氨水，叶酸标准品是溶于碱性环境的，不加氨水溶解不完全，建议除了工作液现用现配外，储备液和中间液先都一起配好，贴好试剂标签，放4℃冰箱保存，还有要注意，配置标准溶液时不要称样，称样的时候不要配置标准溶液，以防交叉污染。
叶酸的测定方法
叶酸的测定方法微生物法1.原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。
在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。
本方法适用于各类食物中叶酸的测定。
检测限为0.1ng。
3.仪器与设备（1）恒温培养箱（2）离心机（3）高压消毒锅（4）震荡器（5）接种针和接种环（6）分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）（2）磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。
临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。
（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。
）（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。
临用前现配。
（4）蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。
临用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。
（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7） 10mol/L NaOH。
称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8）叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。
微孔板法测定乳粉中叶酸含量的不确定度分析
基金项目:湖南省自然科学基金(编号:２０２１J J ８００７７)作者简介:刘子音,女,长沙市食品药品检验所助理研究员,硕士.通信作者:卓一鸣(１９８７ ),男,长沙市食品药品检验所高级工程师,硕士.E Ｇm a i l :７１５４６７３７５＠q q．c o m 收稿日期:２０２３Ｇ０７Ｇ１６㊀㊀改回日期:２０２３Ｇ１１Ｇ２５D O I :１０．１３６５２/j ．s p j x ．１００３．５７８８．２０２３．８０６６３[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２４)０３Ｇ００９５Ｇ０５微孔板法测定乳粉中叶酸含量的不确定度分析A n a l y s i s o f u n c e r t a i n t yi nd e t e r m i n a t i o no f f o l i ca c i d i nm i l k p o w d e r b y m i c r o pl a t em e t h o d 刘子音L I UZ i y i n ㊀卓一鸣Z HU OY i m i n g ㊀刘腊兰LI UL a l a n ㊀彭㊀纳P E N G N a ㊀吴后吕WU H o u l u (长沙市食品药品检验所,湖南长沙㊀４１００１６)(C h a n g s h aI n s t i t u t e f o rF o o da n dD r u g C o n t r o l ,C h a n gs h a ,H u n a n ４１００１６,C h i n a )摘要:目的:对微孔板法测定乳粉中叶酸含量的不确定度进行分析评估.方法:按G B５００９．２１１ ２０２２中微孔板法测定婴儿配方乳粉中叶酸含量,依据J J F１０５９．１ ２０１２㊁C N A S ＧC L ０１ＧG ００３:２０２１和C N A S ＧG L ０５:２０１１等不确定度评定方法和指南对影响检测结果的各种试验因素进行分析㊁计算,得到合成标准不确定度及扩展不确定度.结果:扩展不确定度U ９５＝２２．０８μg /１００g (k ＝２),样品中叶酸含量为(２８２．３３ʃ２２．０８)μg /１００g .不确定度主要来源于接种微孔板过程㊁标准曲线拟合和测量重复性.结论:移液器的准确度和微生物因素对试验结果影响较大,需保证仪器质量并严格按照标准化流程操作以降低不确定度.关键词:叶酸;乳粉;微孔板法;不确定度A b s t r a c t :O b j e c t i v e :T oa n a l y z ea n de v a l u a t et h eu n c e r t a i n t y o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f f o l i c a c i d c o n t e n t i n m i l k p o w d e r b y m i c r o pl a t em e t h o d ．M e t h o d s :T h ec o n t e n to f f o l i ca c i d i n i n f a n t f o r m u l a m i l k p o w d e r w a s d e t e r m i n e d b y m i c r o p l a t e m e t h o d a c c o r d i n g t o G B５００９．２１１ ２０２２＂N a t i o n a lS t a n d a r df o rF o o d S a f e t yＧD e t e r m i n a t i o n o f F o l i c A c i d i n F o o d s ＂．V a r i o u s e x p e r i m e n t a l f a c t o r s a f f e c t i n g t h e t e s t r e s u l t sw e r ea n a l y z e da n d c a l c u l a t e da c c o r d i n g t ot h eu n c e r t a i n t y e v a l u a t i o n m e t h o d sa n d gu i d e l i n e s s u c ha sJ J F１０５９．１ ２０１２,C N A S ＧC L ０１ＧG ００３:２０１１a n dC N A S ＧG L ０５:２０１１,a n dt h es y n t h e t i cs t a n d a r du n c e r t a i n t y a n de x p a n d e du n c e r t a i n t y w e r eo b t a i n e d ．R e s u l t s :T h ee x p a n d e d u n c e r t a i n t y U ９５＝２２．０８μg /１００g (k ＝２),a n d t h e f o l a t e c o n t e n t o f t h es a m p l ew a s (２８２．３３ʃ２２．０８)μg /１００g ．T h eu n c e r t a i n t y m a i n l y c o m e sf r o m t h e p r o c e s so f m i c r o pl a t ei n o c u l a t i o n ,t h e f i t t i n g o fs t a n d a r dc u r v ea n dt h er e p e a t a b i l i t y o f m e a s u r e m e n t ．C o n c l u s i o n :T h e a c c u r a c y o f p i pe t t e s a n dm i c r o b i a lf a c t o r s h a v e ag r e a t i m p a c to nth ee x p e ri m e n t a lr e s u l t s ,s oi t i sn e c e s s a r y to e n s u r et h e q u a l i t y o ft h ei n s t r u m e n t a n d s t r i c t l y f o l l o w t h e s t a n d a r d i z e d p r o c e d u r e s t om i n i m i z e t h eu n c e r t a i n t y ．K e yw o r d s :f o l i ca c i d ;m i l k p o w d e r ;m i c r o p o r o u s p l a t e m e t h o d ;u n c e r t a i n t y叶酸,或称维生素B ９㊁维生素M ,广泛参与人体内蛋白质㊁核酸的代谢和细胞增殖,并且是血红蛋白的组分之一,对人体尤其是孕妇和婴幼儿的健康至关重要[１].孕妇缺乏叶酸可致胎儿畸形,婴幼儿缺乏叶酸会阻碍神经系统发育及引发巨幼细胞性贫血[２－４].中国食品安全标准对婴㊁幼儿配方食品中叶酸含量都有强制性要求[５].叶酸含量的检测方法主要有液相色谱法[６－９]㊁分光光度法[８－９]㊁酶联免疫法[１０－１１]㊁微生物法[１２－１３]等.由于叶酸不稳定,见光㊁受热易分解[１４],因此不适于采用理化方法检测.目前,微生物法是G B５００９．２１１ ２０２２指定的仲裁方法,并在２０１４版的试管法基础上增添了新的微孔板法.微孔板法相较于试管法所耗试剂更少,测定更加快捷,但因培养体积变小,试验的不确定性发生变化.研究拟按G B５００９．２１１ ２０２２中微孔板法对婴儿配方乳粉中的叶酸含量进行同条件下的１０次平行测定,依据C N A S ＧC L ０１ＧG ００３:２０２１㊁C N A S ＧG L ０５:２０１１㊁J J F１０５９．１ ２０１２等标准对影响检测结果的各种因素进行分析和评估,计算各分量的不确定度,综合处理后得到合成标准不确定度及扩展不确定度[１５],以期为实验室质量控制和试验流程优化提供依据.１㊀材料与方法１．１㊀材料与仪器１．１．１㊀耗材试剂婴儿配方乳粉:长沙市食品药品检验所抽检样;叶酸标准品:纯度ȡ９９．０％,国家标准物质中心;５９F O O D &MA C H I N E R Y 第４０卷第３期总第２６９期|２０２４年３月|鼠李糖乳杆菌:A T C C ７４７９,美国模式培养物保藏中心;菌种储备用琼脂培养基㊁叶酸测定用培养基:北京路桥技术股份有限公司;微孔板(９６孔)㊁滤膜(０．２２μm ):美国康宁公司.１．１．２㊀仪器与设备电子天平:B S A ２２４S 型,北京赛多利斯科学仪器有限公司;高压灭菌器:S M ８３０型,重庆雅马拓科技有限公司;生化培养箱:L R H Ｇ２５０F 型,上海一恒科技有限公司;移液器:１m L ㊁２００μL 量程,美国E p p e n d o r f 公司;容量瓶:１００,１０００m L 容积,湖南湘玻科学仪器有限公司;多功能酶标仪:E n s i gh t 型,新加坡P e r k i n E l m e r 公司.１．２㊀试验方法１．２．１㊀标准溶液的配制㊀参照G B５００９．２１１ ２０２２.１．２．２㊀接种液的制备㊀按G B５００９．２１１ ２０２２要求操作,将鼠李糖乳杆菌菌种转接至菌种储备用琼脂培养基中,(３６ʃ１)ħ恒温培养２０~２４h ,连续传种２~３代,挑取单菌落接种至含有叶酸的叶酸测定用培养液中,(３６ʃ１)ħ恒温培养２０~２４h ,转接至不含叶酸的叶酸测定用培养液中饥饿培养６h ,得到接种液.１．２．３㊀样液制备㊀称取约０．１g 样品于锥形瓶中,加入８０m L 氢氧化钠乙醇溶液,具塞,超声振荡２h ,转入１００m L 容量瓶中,用无菌水定容.取１m L 无菌水稀释１０倍,过滤除菌,得到样品待测液.１．２．４㊀样品测定㊀按G B５００９．２１１ ２０２２中微孔板法制备试样系列管和标准系列管(均过滤除菌),与含有接种液的测定用培养基(４０μL 接种液/１０m L 培养基)各１５０μL 一起转接至微孔板,覆膜,混匀,于(３６ʃ１)ħ恒温培养３２~４０h ,用酶标仪快速测定５４０n m 处吸光值(若０对照孔出现浑浊,说明可能有杂菌污染,需重做).１．２．５㊀数学模型的建立㊀按式(１)计算样品中叶酸含量.X ＝c ˑV ˑf m ˑ１００１０００,(１)式中:X 样品中叶酸含量,μg /１００g ;c 样品待测液叶酸浓度的平均值,n g /m L ;V 样品溶液定容体积,m L ;f样品溶液稀释倍数;m 样品称取量,g.１．２．６㊀数据处理㊀对各分布类型数据的处理方法及运用到的计算公式参考J J F１０５９．１ ２０１２;标准曲线的二项式回归方程由E x c e l 程序生成;二项式方程转换为直线方程的处理方法参考相关文献.２㊀结果与分析２．１㊀不确定度来源微孔板法测定叶酸含量过程中的不确定度来源主要有:①标准溶液制备引入的不确定度,包括标准品的纯度㊁标准物质的称量㊁稀释,标准系列管的配制;②样液制备引入的不确定度,包括样品的称量和稀释,试样系列管的配制;③接种微孔板过程引入的不确定度;④拟合标准曲线引入的不确定度;⑤酶标仪仪器误差产生的不确定度;⑥测量重复性引入的不确定度.２．２㊀各不确定度分量评定２．２．１㊀标准溶液制备引入的不确定度(１)标准品纯度引入的不确定度:说明书显示其纯度p ȡ９９．０％,考虑其在９９．０％~１００．０％区间按均匀分布,则区间半宽度为０．００５,包含因子k ＝３,其标准不确定度u (P )＝０．００５３＝０．００２９,相对标准不确定度u r e l (P )＝u (P )P ＝０．００２９０．９９＝０．００２９.(２)标准品称量引入的不确定度:用万分之一天平准确称取２０．２m g 叶酸标准品,天平引入的不确定度主要来源于示值校准㊁分辨率和重复性.电子天平校准证书显示,其在０~１g 范围内示值的扩展不确定度为０．３m g(k ＝２),则标准不确定度u (m 示)＝U k ＝０．３m g２＝０．１５m g ;电子天平分辨率为０．１m g ,半区间取０．０５m g ,按均匀分布处理,包含因子k ＝３,则标准不确定度u (m 辨)＝０．０５m g ３＝０．０２９m g.合成二者的标准不确定u (m s １)＝u (m 示)２＋u (m 辨)２＝０．１５２＋０．０２９２＝０．１５３m g,去皮和称样共用了两次天平,合成两次的不确定度u (m s ２)＝２ˑu (m s １)２＝０．２１６m g ,相对标准不确定度u r e l (m s )＝u (m s ２)m ＝０．２１６m g２０．２m g＝０．０１０７.(３)配制标准工作液引入的不确定度:将称取的标准品溶解定容至１０００m L 容量瓶中,制成叶酸标准储备液,并吸取１．０m L 定容至１００m L 容量瓶制成叶酸标准中间液,从中间液中吸取１．０m L 定容至１０００m L 容量瓶中得到叶酸标准工作液.配制过程使用到１０００m L容量瓶２次,１００m L 容量瓶１次,１m L 移液器２次.容量瓶和移液器的校准㊁测量重复性㊁温度波动引起的液体体积变化是溶液配制过程不确定度的主要来源,由各量具校准证书查得其在检定温度２０ħ时容量校准的扩展或相对扩展不确定度,则相应的标准或相对标准不确定度＝扩展/相对扩展不确定度包含因子k,具体结果见表１.６９安全与检测S A F E T Y &I N S P E C T I O N 总第２６９期|２０２４年３月|表１㊀标准工作液配制过程量具校准引入的不确定度T a b l e １㊀C a l i b r a t i o nu n c e r t a i n t y o f g a u g e s i n p r e pa r a t i o n o f s t a n d a r dw o r k i n g so l u t i o n 量具使用次数扩展/相对扩展不确定度(k ＝２)标准不确定度/m L 相对标准不确定度１０００m L 单标容量瓶２０．２０m L ０．１㊀㊀１．０ˑ１０－４１００m L 单标容量瓶１０．０３m L ０．０１５１．５ˑ１０－４１m L 量程移液器２０．３％０．００１５１．５ˑ１０－３㊀㊀水在２０ħ时膨胀系数为２．１ˑ１０－４ħ－１,设室温波动为ʃ５ħ,按均匀分布计算,k ＝３,则温度引起的不确定度u (t )＝２．１ˑ１０－４ħ－１ˑ５ħˑV 取液量３,每使用一次容量瓶或移液器都会引入该不确定度.试验环境不变时,其相对标准不确定度u r e l (t )＝u (t )V 取液量＝６．０ˑ１０－４,为固定值.㊀㊀合成标准工作液配制过程引入的相对不确定度:u r e l (V s １)＝[２ˑ(１．０ˑ１０－４)２＋(１．５ˑ１０－４)２＋２ˑ(１．５ˑ１０－３)２＋５ˑ(６．０ˑ１０－４)２]１２＝０．００２５.(４)配制标准系列管引入的不确定度:使用２００μL 和１m L 量程移液器吸取０,０．０５,０．１０,０．２０,０．３０,０．４０,０．５０,０．６０,０．８０,１．００m L 叶酸标准工作液至离心管,补水至１．０m L ,共１０个梯度,其间移液器校准引入的不确定度见表２.吸取标准工作液使用了移液器９次,因此计入９次温度引起的不确定度,合成标准系列管配制过程引入的相对不确定度u r e l(V s ２)＝３ˑ(２．５ˑ１０－３)２＋６ˑ(１．５ˑ１０－３)２＋９ˑ(６．０ˑ１０－４)２＝０．００６０.表２㊀标准系列管配制过程量具校准引入的不确定度T a b l e ２㊀C a l i b r a t i o nu n c e r t a i n t y o f g a u g e s i n p r e pa r a t i o n o f s t a n d a r d s e r i e s t ub e s量具使用次数相对扩展不确定度(k ＝２)/％相对标准不确定度２００μL 量程移液器３０．５２．５ˑ１０－３１m L 量程移液器６０．３１．５ˑ１０－３㊀㊀(５)合成标准溶液制备过程引入的相对不确定度:综合计算标准品纯度㊁标准品称量㊁标准工作液配制㊁标准系列管配制４部分的相对不确定度分量,合成标准溶液制备引起的相对标准不确定度u r e l (S )＝u r e l (P )２＋u r e l (m s )２＋u r e l (V s １)２＋u r e l (V s ２)２＝(２．９ˑ１０－３)２＋(１．０７ˑ１０－２)２＋(２．５ˑ１０－３)２＋(６．０ˑ１０－３)２＝０．０１２９.２．２．２㊀样液制备引入的不确定度(１)样品称量引入的不确定度:用称取标准品同一万分之一天平准确称取１０３．５m g 乳粉试样.已知该天平完成一次０~１g 范围内的称量(去皮＋称样)引起的不确定度u (m ２)＝０．２１６m g,则此次称量的相对标准不确定度u r e l (m t )＝０．２１６m g１０３．５m g ＝０．００２１.(２)配制样品待测液引入的不确定度:样品溶液定容与稀释使用了１次１００m L 容量瓶㊁１次１m L 量程移液器㊁１次１０m L 单标试管,由各自的校准证书查得其在２０ħ时容量校准的扩展或相对扩展不确定度,计算得到各自的相对标准不确定度,见表３.计入３次温度引起的不确定度,则合成相对标准不确定度u r e l (V t １)＝(２．０ˑ１０－４)２＋(１．５ˑ１０－３)２＋(５．０ˑ１０－４)２＋３ˑ(６．０ˑ１０－４)２＝０．００２１.表３㊀样品待测液配制过程量具校准引入的不确定度T a b l e ３㊀C a l i b r a t i o nu n c e r t a i n t y o f g a u g e s i n p r e pa r a t i o n o f s a m pl e t e s t s o l u t i o n 量具使用次数扩展/相对扩展不确定度(k ＝２)标准不确定度/m L 相对标准不确定度１００m L 单标容量瓶１０．０４m L ０．０２㊀２．０ˑ１０－４１m L 量程移液器１０．３％０．００１５１．５ˑ１０－３１０m L 单标试管１０．０１m L ０．００５５．０ˑ１０－４㊀㊀(３)配制试样系列管引入的不确定度:用１m L 量程移液器吸取０．１,０．２,０．３m L 试样待测液至离心管,补水至０．５m L ,移液器校准引入的不确定度见表３.吸取样液使用了移液器３次,计入３次温度引起的不确定度,合成试样系列管配制引入的相对不确定度u r e l (V t ２)＝３ˑ(１．５ˑ１０－３)２＋３ˑ(６．０ˑ１０－４)２＝０．００２９.(４)合成样液制备过程引入的相对不确定度:综合计算样品称量㊁样品待测液配制㊁试样系列管配制３部分的相对不确定度分量,得到样液制备引起的合成相对标准不确定度u r e l (T )＝u r e l (m t )２＋u r e l (V t １)２＋u r e l (V t ２)２＝(２．１ˑ１０－３)２＋(２．１ˑ１０－３)２＋(２．９ˑ１０－３)２＝０．００４２.２．２．３㊀接种微孔板引入的不确定度㊀使用２００μL 量程移液器,每孔接种１５０μL 含鼠李糖乳杆菌的叶酸测定用培养基和１５０μL 标准系列管或试样系列管.由表２可知,该２００μL 量程移液器校准引入的相对标准不确定度为２．５ˑ１０－３.标准管每个点设３个平行孔,试样管每个梯度设２个平行孔,共接种３６孔,每孔使用２次移液器,计入７２次温度引起的不确定度,则接种微孔板过程引入的相对标准不确定度u r e l(I )＝７２ˑ(２．５ˑ１０－３)２＋７２ˑ(６．０ˑ１０－４)２＝０．０２１８.２．２．４㊀拟合标准曲线引入的不确定度㊀试验原理是利用７９|V o l ．４０,N o ．３刘子音等:微孔板法测定乳粉中叶酸含量的不确定度分析鼠李糖乳杆菌的生长速率与环境中叶酸含量成正比,通过检测菌液浊度可反映培养基中初始叶酸含量.理想状态以叶酸初始含量为横轴,吸光度为纵轴建立的标准曲线应为直线,但由于培养过程中叶酸不断消耗,乳杆菌产生的有害代谢物不断累积,实际的生长曲线会逐渐趋于平缓,因此将标准曲线拟合成二次方程较为符合实际情况,具体数据见表４,得回归方程Y ＝－２３２．５２x ２＋２２．７７５x ＋０．１８２１,R ２＝０．９９７４.㊀㊀先将二次曲线方程转化成一次直线方程[１６]:Y ＝－２３２．５２x ２＋２２．７７５x ＋０．１８２１＝－２３２．５２(x －０．０４９０)２＋０．７３９,令Z ＝(x －０．０４９０)２,则原方程可以转化为Y ＝a Z ＋b ＝－２３２．５２Z ＋０．７３９,斜率a ＝－２３２．５２,截距b ＝０．７３９,标准曲线校准点吸光度值残差的标准差:S z ＝ðni ＝１[Y i －(a Z i ＋b )]２n －２,(２)式中:n标准系列管孔数;Y i仪器测得的各标准系列管吸光度值(即表４表４㊀标准曲线试验数据T a b l e ４㊀S t a n d a r d c u r v e e x pe r i m e n t a l d a t a 每孔叶酸标准品含量/n g 吸光度值A １A ２A ３A０．０００００．１９００．１８６０．１８９０．１８８０．００１５０．２１１０．２１００．２１５０．２１２０．００３００．２３９０．２２８０．２３６０．２３４０．００６００．３１８０．３１５０．３２８０．３２００．００９００．３８４０．３６９０．３９００．３８１０．０１２００．４２３０．４１３０．４２１０．４１９０．０１５００．４６００．４４８０．４７７０．４６２０．０１８００．５１１０．５１９０．５２３０．５１８０．０２４００．５９８０．５９１０．５９６０．５９５０．０３０００．６５８０．６６７０．６４７０．６５７中A １~A ３数值);a Z i ＋b 由标准曲线公式算得的理论吸光度值(见表５).由标准曲线拟合引入的不确定度:u (c )＝S z|a |１p＋１n ＋( C － Z )２ðni ＝１(Z i － Z)２,(３)式中:p 试样系列管孔数;C测得的各试样系列管叶酸含量转换为Z 后的平均值;Z i各标准系列管叶酸含量转换为Z 后的值; Z各标准系列管叶酸含量转换为Z 后的平均值(见表５).将６个试样孔所得的吸光值代入一次方程中,得到相应Z 的值,取其平均数可得 C ＝０．００１０１９,结合表５可得,u (c )＝０．０１０５２３２．５２１６＋１３０＋(０．００１０１９－０．００１４６９)２０．０００００４３７＝２．２４ˑ１０－５,u r e l(c )＝u (c )C ＝２．２４ˑ１０－５１．０２ˑ１０－３＝０．０２２０.２．２．５㊀酶标仪测定引入的不确定度㊀多功能酶标仪检定证书给出的吸光度示值校准的相对扩展不确定度U ＝０．０１２(k ＝２),则使用酶标仪引入的相对不确定度u r e l (E )＝０．０１２２＝０．００６.２．２．６㊀测量重复性引入的不确定度㊀重复性引入的不确定度适合按A 类不确定度评定方法计算.对该乳粉样品进行１０次平行测定,使用贝塞尔公式计算标准偏差S (R )＝７．４７１９.标准要求报告取两个平行结果的平均值,因此重复性引入的不确定u (R )＝S (R )２＝５．２８３４,相对不确定度u r e l (R )＝u (R )X ＝５．２８３４２８２．３３＝０．０１８７.表５㊀标准曲线各校准点叶酸含量离均差及吸光度值残差T a b l e ５㊀M e a nd e v i a t i o no f f o l a t e a n d r e s i d u a l a b s o r b a n c e v a l u e a t e a c hc a l i b r a t i o n p o i n tZ i(Z i －Z )２a Z i ＋b [Y i －(a Z i ＋b )]２０．００２４０１０．００００００８７０．１８０７１９０．００００８６０．００００２８０．００００６９０．００２２５６０．００００００６２０．２１４３７７０．００００１１０．００００１９０．０００００００．００２１１６０．００００００４２０．２４６９８８０．００００６４０．０００３６１０．０００１２１０．００１８４９０．００００００１４０．３０９０７１０．００００８００．００００３５０．０００３５８０．００１６０００．０００００００２０．３６６９６８０．０００２９００．０００００４０．０００５３００．００１３６９０．０００００００１０．４２０６８００．０００００５０．００００５９０．０００００００．００１１５６０．００００００１００．４７０２０７０．０００１０４０．０００４９３０．００００４６０．０００９６１０．００００００２６０．５１５５４８０．００００２１０．００００１２０．００００５６０．０００６２５０．００００００７１０．５９３６７５０．００００１９０．０００００７０．０００００５０．０００３６１０．０００００１２３０．６５５０６００．０００００９０．０００１４３０．００００６５８９安全与检测S A F E T Y &I N S P E C T I O N 总第２６９期|２０２４年３月|２．３㊀合成标准不确定度综上,接种微孔板㊁拟合标准曲线和测量重复性三者对试验结果影响较大:接种微孔板引入的不确定度主要来自所使用移液器的校准;拟合标准曲线引入的不确定度主要与微生物生长状况的发散性相关;测量重复性引入的不确定度与试验仪器精密度㊁人员操作稳定性及微生物生长状况的发散性相关,其中后者起关键作用.将各不确定度分量综合计算,得到此次叶酸测定的合成标准不确定度u(X)＝Xˑu r e l(X)＝Xˑu r e l(S)２＋u r e l(T)２＋u r e l(I)２＋u r e l(C)２＋u r e l(E)２＋u r e l(R)２＝２８２．３３ˑ０．０１２９２＋０．００４２２＋０．０２１８２＋０．０２２２＋０．００６２＋０．０１８７２＝１１．０４μg/１００g.２．４㊀扩展不确定度该检测结果属于正态分布,当置信水平为９５％时,包含因子k＝２,扩展不确定度U＝u(X)ˑk＝１１．０４ˑ２＝２２．０８μg/１００g.此次测定的乳粉样品中叶酸含量可表示为(２８２．３３ʃ２２．０８)μg/１００g.３㊀结论微孔板法的引入是国标叶酸测定方法的一次优化,其相较于传统的试管法,首先成倍减少了培养基的用量,降低了试验成本.其次,标准管和试样管改用过滤灭菌替代高压灭菌,避免了叶酸受热分解影响检测结果.再次,使用一次性微孔板代替试管,一方面避免了试管因未洗净带入残留造成不良影响,一方面微孔板可以直接使用酶标仪一次性读取全部孔结果,避免了使用分光光度计时逐管测定频繁操作造成的干扰.但新方法有其相应的不确定性.试验表明,该样品中叶酸含量可表示为(２８２．３３ʃ２２．０８)μg/１００g(置信度９５％).新增的接种微孔板步骤以及拟合标准曲线㊁测量重复性,三者是不确定度的主要来源.接种微孔板过程需频繁使用移液器,选用质量较好的移液器能有效降低该不确定度分量.后二者涉及鼠李糖乳杆菌的培养,而微生物的生长状况发散性较大,其影响因素主要有:所用菌株的活性㊁样品基质所含杂质㊁培养基的质量㊁培养条件如温度㊁时长[１７].因此,选用性状稳定㊁正规来源的新鲜标准菌株,确保待测样品不含除叶酸外影响鼠李糖乳杆菌生长的其他成分,选用正规厂商培养基并严格按要求配制,使用经检定的恒温培养箱,在适宜的菌液浓度(孔底未出现沉淀)时收取等措施能尽可能降低微生物因素引起的不确定度.标准品和样品的称量㊁稀释,标准溶液和样液的配制,以及酶标仪的仪器误差是不确定度的次要来源,可通过使用精密度更高的仪器并注意维护保养㊁定期检定以减小该部分的影响.参考文献[1]王宏亮.维生素的概述及研究进展[J].临床药物治疗杂志, 2022,20(12):40Ｇ45.WANG H L.Overview and research progress of vitamins[J]. 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叶酸酶标法数据
叶酸酶标法数据
叶酸酶标法（Folate enzyme immunoassay）是一种常用的方法
来测定叶酸（Folate）的含量。
该方法主要包括以下步骤：
1. 样品预处理：将待测样品（如血清、尿液、食物等）进行预处理，如去除干扰物质、稀释等。
2. 酶标记：将叶酸与酶进行结合，常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
3. 抗体结合：将酶标记的叶酸与待测样品中的叶酸结合，形成抗原-抗体复合物。
4. 洗涤：通过洗涤剂将未结合的物质洗除，以减少非特异性信号。
5. 底物添加：加入酶的底物，使其在酶的催化下发生变色反应。
6. 反应终止：加入反应终止剂停止底物反应，停止颜色变化。
7. 读数和计算：使用分光光度计或荧光分析仪等仪器，测定底物反应产生的吸光度或荧光强度，通过与标准曲线对比，计算样品中叶酸的浓度。
叶酸酶标法数据是通过上述步骤，测得的叶酸浓度数据。
这些数据可以用于研究叶酸在生物体内的含量变化、评估营养状况、诊断叶酸相关疾病等。
叶酸食品级fcc质量标准
叶酸是一种重要的维生素，对于人体的发育和健康起着至关重要的作用。
为了确保叶酸产品的质量和安全性，制定了一系列的质量标准。
其中，食品级FCC（Food Chemicals Codex）质量标准是广泛应用于食品行业的一项标准。
本文将详细介绍叶酸食品级FCC 质量标准，包括其定义、要求和相关检测方法。
一、叶酸食品级FCC质量标准的定义叶酸食品级FCC质量标准是指符合食品化学法典（Food Chemicals Codex）规定的叶酸质量要求的产品。
该标准包括对叶酸产品的纯度、含量、物理性质、微生物指标等方面的要求。
二、叶酸食品级FCC质量标准的要求1. 纯度要求：叶酸食品级FCC标准要求叶酸产品的纯度达到一定的标准。
其中，有机杂质的含量要低于规定的限量，无机盐类的含量也要符合要求。
此外，还要求叶酸产品不得含有对人体有害的物质，如重金属等。
2. 含量要求：叶酸食品级FCC标准对叶酸产品的含量有详细的规定。
一般来说，叶酸产品的含量应在一定的范围内，并且要与产品标签上所示的含量相符合。
3. 物理性质要求：叶酸食品级FCC标准还对叶酸产品的物理性质进行了要求。
例如，叶酸产品的外观应为无色结晶或结晶性粉末，不应有异物。
此外，还要求叶酸产品的溶解度、熔点、旋光度等物理性质符合规定。
4. 微生物指标要求：叶酸食品级FCC标准对叶酸产品的微生物指标也有一定的要求。
例如，叶酸产品的总菌落数、霉菌和酵母菌的数量都应低于规定的限值。
另外，对大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌的检测结果也必须符合相关标准。
三、叶酸食品级FCC质量标准的检测方法为了评估叶酸产品是否符合食品级FCC质量标准的要求，需要进行相应的检测。
以下是常用的叶酸检测方法：1. 高效液相色谱法（HPLC）：该方法是目前最常用的叶酸含量测定方法。
通过将叶酸样品与特定试剂反应后，利用高效液相色谱仪进行分离和定量分析，可以准确测定叶酸的含量。
2. 紫外分光光度法：该方法是一种快速测定叶酸含量的方法。
叶酸液相色谱检测方法
叶酸液相色谱检测方法1. 引言1.1 背景介绍叶酸是一种B族维生素，也被称为维生素B9，是人体生长发育和细胞分裂所必需的营养物质。
叶酸在体内主要参与DNA和RNA的合成，对胎儿脑部和脊柱的发育具有重要影响。
由于人体无法自行合成叶酸，因此需要通过饮食来摄入。
叶酸缺乏可能导致贫血、胎儿神经管缺陷、心血管疾病等严重健康问题。
为了准确检测叶酸的含量，液相色谱检测方法应运而生。
液相色谱是一种高效、精确的分析方法，通过样品溶液在固定相中的移动速度差异来分离和检测不同物质。
叶酸液相色谱检测方法具有高灵敏度、高准确性、高分辨率的优势，已被广泛应用于食品安全、生物医学等领域。
本文旨在介绍叶酸的生物学功能、叶酸缺乏的危害、液相色谱检测方法的原理和步骤，以及叶酸液相色谱检测方法的优势和应用前景，以加深对叶酸及其检测方法的理解。
1.2 研究目的研究目的是为了建立一种高效、准确、稳定的叶酸液相色谱检测方法，以满足日益增长的叶酸检测需求。
通过对叶酸的生物学功能和缺乏危害的深入研究，我们可以更好地了解叶酸在人体中的作用和重要性。
探讨液相色谱检测方法的原理和步骤，可以帮助我们更好地理解该方法的工作机制和操作流程。
分析叶酸液相色谱检测方法的优势，可以帮助我们更好地评估该方法在叶酸检测中的作用和价值。
最终，通过探讨叶酸液相色谱检测方法的应用前景和意义，可以为该方法的推广和应用提供理论支持和指导，为叶酸检测及相关领域的研究和临床应用提供有益参考。
2. 正文2.1 叶酸的生物学功能叶酸是一种维生素B族的重要成员，也被称为维生素B9。
它在人体内扮演着多种重要的生物学功能。
叶酸在DNA合成过程中起着关键的作用，帮助细胞进行分裂和生长，对胎儿的神经系统发育至关重要。
叶酸还参与了氨基酸代谢，并帮助维持正常的红细胞形成。
叶酸在蛋白质代谢和细胞信号传导中也发挥着重要作用。
叶酸的生物学功能在身体内是十分复杂而精密的，对许多生理过程都有着重要影响。
确保身体充足的叶酸水平对于维持身体健康至关重要。
食品安全国家标准食品中叶酸叶酸盐的测定征求意见稿
文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.食品安全国家标准食品中叶酸（叶酸盐）的测定中华人民共和国卫生部发布4.1前言本标准代替GB/T 5009.211-2008《食品中叶酸的测定》。
本标准与GB/T 5009.211-2008相比，主要变化如下：——修改了菌种名称,由干酪乳杆菌改为鼠李糖乳杆菌；——删除了培养基和用于叶酸盐降解的鸡胰腺供货信息。
本标准中附录A、B均为资料性附录。
（本标准中附录性质的说明）本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB/T 5009.211-2008。
食品安全国家标准食品中叶酸（叶酸盐）的测定1范围本标准规定了食品中叶酸（叶酸盐）的测定方法。
本标准适用于食品中叶酸（叶酸盐）的测定。
2原理叶酸是细菌生长所必需的营养素，在一定控制条件下，细菌的生长响应与培养基中叶酸含量呈线性关系。
用比浊法测定试样液中细菌增殖后的混浊度，通过与标准曲线相比较计算出试样中叶酸的含量。
3试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1甲苯（C7H8）。
3.2磷酸钠（Na3PO4·12H2O）。
3.3磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）。
3.4抗坏血酸（C6H8O6）。
3.5无水乙醇（C2H6O）。
3.6氢氧化钠（NaOH）。
3.7盐酸（HCl）。
3.8鸡胰腺（Chicken Pancreas）。
3.9木瓜蛋白酶（Papain）。
3.10淀粉酶（Taka-Diastase）。
3.11叶酸（C19H19N7O6）：纯度＞98 %。
3.12葡萄糖（C6H12O6）。
3.13蛋白胨（peptone）。
3.14酵母提取物（yeast extract）。
3.15琼脂。
3.16磷酸氢二钾（K2HPO4）。
3.17磷酸二氢钾（KH2PO4·3H2O）。
3.18硫酸镁（MgSO4·7H2O）。
3.19氯化钠（NaCl）。
叶酸测定微生物法
叶酸测定微生物法叶酸测定微生物法是一种利用微生物的生物学特性来测定食品、药品、营养补充剂等物质中叶酸含量的方法。
在此方法中，通常使用特定的微生物菌株（如粪链球菌ATCC 8043）作为指示生物，因为这些菌株的生长需要叶酸。
基本原理：1.培养基制备：制备一种特定的培养基，这种培养基除了叶酸以外的所有营养成分都需包含，以确保接种的微生物能够生长。
2.接种与培养：将待测样品或标准溶液接种到制备好的培养基上，然后在适宜的温度和湿度下培养。
3.生长观察：在培养过程中，如果样品中含有叶酸，那么粪链球菌等指示微生物就会生长。
4.结果判断：通过观察微生物的生长情况来判断样品中叶酸的含量。
通常，生长程度越强，表明样品中叶酸含量越高。
方法步骤：1.标准溶液制备：准备一系列不同浓度的叶酸标准溶液，用于制作标准曲线。
2.样品处理：将待测样品按照一定的方法处理，提取叶酸。
3.接种培养：将处理好的样品或标准溶液接种到培养基上，进行培养。
4.生长测定：通过比色、浊度计测量等方式，测定指示微生物的生长情况。
5.数据分析：将测定结果与标准曲线对比，计算样品中叶酸的含量。
注意事项：培养基的成分和制备方法需要严格按照标准进行，以确保结果的准确性。
接种和培养的条件（如温度、湿度、时间等）也需要严格控制。
微生物的生长可能会受到其他维生素和营养因素的影响，因此需要排除这些干扰因素。
在操作过程中，需要遵循无菌操作的原则，避免污染。
应用范围：叶酸测定微生物法不仅用于食品检测，还可用于医药、营养补充剂等领域的叶酸含量测定。
这种方法因其准确性和可靠性，被广泛应用于叶酸的定量分析。
但需要注意的是，具体操作时还需参照最新的国家标准和行业规范，确保检测结果的科学性和法律效力。
HPLC法测定保健食品中叶酸含量及稳定性研究
H PLC法测定保健食品中叶酸含量及稳定性研究张国梅张舟艺徐水祥李跃中孙丽华$(浙江省医学科学院，杭州310013)摘要：目的建立测定保健食品中叶酸含量的液相色谱法，并用于考察保健食品中叶酸的稳定性研究。
方法 样品中的叶酸经0. 5Q氨水热水浴20分钟提取后，经ZORBAXSB-C18(150m m X4. 6 mm$ #m)分离，流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇！0 : 30, V/V)，流速：1.0 mL/ min;紫外检测波长为280 nm，根据保留时间定性，外标峰面积法定量#结果叶酸在S 685 #g/ m L!74.960 #g/ m L内线性关系良好（r=1)，样品的加标回收率为9S 8%!97.6%，平均回收率为96.0%，R S D为1.1%;检出限为0.18 #g/ m L;定量限为0.60 #g/ m L#样品经过3个月的加速破坏性试验后，检测其中的叶酸含量平均下降比率为2.6%。
结论该方法具有操作简便快速、分离效果好、精密度和准确性高、重现性好的特点，可为叶酸类保健食品的质量控制提供方法参考。
同时经稳定性试验发现样品中叶酸的含量变化不大，具有良好的稳定性#关键词：保健食品叶酸高效液相色谱稳定性D O I:10. 3969/. issn. 1001 —232x.2019. 01. 031D eterm in ation o f fo lic a cid in health fo o d b y H P L C and its stab ility study.Z h a n g G u o m e i，Z h a n gZ h o u y i，X u S h u i x i a n g，L i Y u e z h o n g，S u n L ih u a ${Z h e j i a n g A c a d e m y o f M e d i c a l S c i e n c e s，H a n g z h o u 310013, C h in a)A b s t r a c t：T h e fo lic acid in th e sa m ple w a s e x tra cte d w ith 0. 5%am m on ia in h o t w a ter fo r 20 m in u te s，th e sep a ra tion w a s p e r fo rm e d on a Z O RB A X SB-C18 co lu m n(150 m m X 4. 6 m m，5 #m).T h e m o b ileph ase o f p h o sp h a te b u ffe r-m e th a n o l(70 :30,V/V) w as u sed at a flo w rate o f 1. 0 m l/m in and th e U V d ete c tio n w a v e le n g th w a s set at280 n m.A c c o r d in g to th e re te n tion t im e，th e e x tern a l stan dard m e th o db a sed on peak areas w a s u sed fo r q u a n tifica tio n.F o lic acid had a g o o d lin ea rity(r=1) in the ran ge o f4. 685—74. 960#g/ m l.T h e r e co v e rie s w e re in th e ran ge o f94. 8%—97. 6 % ；th e av erag e r e c o v e r y w as 96.0%and th e R S D w a s 1.1%.T h e d e te ctio n lim it w a s 0. 18#g/ m l w h ile th e lim it o f q u a n tifica tio n w as 0. 6#g/ m l.T h e a verage decrea se rate o f fo lic acid w a s2.6%after th ree m o n th s o f a ccele ra ted d e stru ctiv ete sts on th e s a m p le s.T h e m e th o d is s im p le，f a s t，re p ro d u c ib le and o f g o o d sep a ra tio sion and a ccu ra cy.M e a n w h ile，th e co n te n ts o f fo lic acid in th e sa m p les did n ot ch a n g e s ig n ific a n tly，w h ichin d icated that th e fo lic acid w as sta b le in th e sa m p le.K ey w o r d s：H e a lth f o o d；F o lic a c id；H ig h p e rfo rm a n ce liq u id c h r o m a to g r a p h y；S ta b ility叶酸是一种重要的维生素，参与人体的许多生理活动，是维生素B复合体之一，最初从菠菜叶中提取纯化，故命名为叶酸。
叶酸的测定方法
叶酸的测定方法微生物法1.原理叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。
在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。
本方法适用于各类食物中叶酸的测定。
检测限为0.1ng。
3.仪器与设备（1）恒温培养箱（2）离心机（3）高压消毒锅（4）震荡器（5）接种针和接种环（6）分光光度计4.试剂除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1）菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）（2）磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH6.8):称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。
临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。
（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。
）（3）鸡胰酶溶液：称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。
临用前现配。
（4）蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。
临用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。
（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7） 10mol/L NaOH。
称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8）叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。
食品中叶酸的不确定度评定报告
食品中叶酸的不确定度评定报告测量不确定度是表征合理赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数，其决定了测量结果的使用价值。
本分析方法根据GB5009.211-2014 《食品安全国家标准食品中叶酸的测定》的方法，建立叶酸的测定方法，进行不确定度的测量和评定，以期为评定测量结果质量提供科学依据。
1 材料与方法1.1材料与试剂1.2材料与试剂叶酸标准品：SUPELCO 500mg/瓶。
叶酸标准品：纯度≥99%。
氢氧化钠分析纯无水乙醇色谱纯叶酸测定培养基MRS培养基鼠李糖乳杆菌（ATCC 7469）1.3 仪器与设备分析天平:万分之一天平梅特勒-托利多仪器有限公司编号:Y-024 精确度0.0001g。
酶标仪：美国伯腾仪器有限公司Y-012超声波振荡器：湖南湘仪实验仪器开发有限公司F-038电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂36℃±1℃ Y-003高压蒸汽灭菌器：121℃（0.10MPa-0.12MPa）Y-010离心机：转速≥3000r/min 湖南湘仪实验仪器开发有限公司Y-0331.4方法简述1.4.1准确称取固体试样1g，精确至0.001g。
转入100ml锥形瓶中，加入80ml氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声4h至试样完全溶解或分散，用水定容至刻度。
根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当的稀释，使试样稀释液中叶酸含量在0.2ng/ml-0.6ng/ml范围内。
所用试管使用前洗刷干净，沸水浴30min，沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2小时，经170±2℃烘干3h后使用。
1.4.2试样和酶空白系列管取3支试管，分别加入0.5ml 、1ml 、2.0ml 试样稀释液（V1），补水至5.0ml 。
加入5ml 叶酸测定用培养液，混匀。
制备3套以上系列管。
1.4.3标准系列管取试管分别加入标准工作液0.00ml 、0.25ml 、0.50ml 、1.00ml 、1.50ml 、2.00ml 、2.50ml 、3.00ml 、4.00ml 和5.00ml ，补水至5.00ml ，相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ng 、0.05ng 、0.10ng 、0.20ng 、0.30ng 、0.40ng 、0.50ng 、0.60ng 、0.80ng 、1.00ng ，再加入5.0ml 叶酸测定培养液，混匀。
荧光分光光度计法测定叶酸的含量
荧光分光光度法测定食品中叶酸的含量叶酸〔1〕是一种重要的B 族维生素,其化学名称为蝶酰谷氨酸。
叶酸的测定方法主要有微生物法〔2〕、HPLC 法〔3〕、荧光法和放射免疫法〔4〕等。
国标法〔5〕测定叶酸是微生物法,选用的菌种可利用培养基中叶酸单谷氨酸和双谷氨酸盐进行生长,灵敏度较高,但是检测需要的时间较长。
由于食品成分复杂,试样处理烦琐费时,而测定的是叶酸盐活性,需制备各种培养基和菌种,步骤多且试剂用量大,微生物法叶酸衍生物繁多,标准品来源有限,存在多种干扰因素,分析方法受到限制。
本文采用超声波提取荧光分光光度法测定食品中的叶酸含量,方法简便、快速,取得满意结果。
现报告如下。
1 材料和方法111 原理叶酸中具有吡嗪- 嘧啶环,它具有特殊的吸收光谱及氧化还原特性。
在紫外光的照射下产生强的兰色荧光。
其荧光强度与标准溶液浓度成线形关系,用磷酸缓冲溶液超声波提取品中的叶酸,提取液经净化后除去其他荧光物质,测定其荧光强度,通过与标准曲线比较,求出样品中叶酸的含量。
112 试剂(1) 叶酸标准贮备液(100μg/ ml) :准确称取10mg 叶酸标准品(CHEMSERVICE 公司,纯度> 98 %) ,加入几滴氢氧化钠溶液助溶,用蒸馏水定容至100.00 ml 。
(2) 叶酸标准工作液(2μg/ ml) :准确吸取2.00 ml 叶酸标准贮备液,用水定容至100.00 ml 。
(3) 20 %冰乙酸溶液。
(4) 磷酸缓冲溶液:pH = 6.8 。
(5) 4 %高锰酸钾溶液。
(6) 3 %H2O2 。
(7) 蛋白酶一淀粉酶溶液:分别称取200 mg 蛋白酶和淀粉酶,加入20ml 磷酸缓冲液制成匀浆,离心,取上清液备用。
临用前配制。
113 仪器RF - 5000 荧光分光光度计,日本岛津。
狭缝宽度5 nm;Ex = 370 nm;Em = 455 nm。
114 标准曲线的绘制准确吸取0.00 ,0.50 ,1.00 ,2.00 ,3.00 ,4.00 ,5.00 ml 叶酸标准工作液,分别置于10.00 ml 的比色管中,加20 %冰乙酸0.1 ml ,4 %高锰酸钾逐滴加至高锰酸钾色不褪色为止,将混合物静置10 min ,然后逐滴向溶液中滴加3 %过氧化氢溶液,直至高锰酸钾的颜色褪掉,用蒸馏水定容至刻度。
叶酸溶出度方法
叶酸溶出度方法是一种测试叶酸在某种食品或饮料中的溶出率的方法，通常用于评估食品或饮料中叶酸的稳定性和生物利用度。
以下是叶酸溶出度方法的步骤：
准备样品：取一定量的待测食品或饮料样品，加入适量的缓冲液中，然后加入叶酸稀溶液，混合均匀。
体外模拟消化：将样品在体外进行模拟消化，一般包括胃液、胆汁、肠液等消化液。
每个步骤的时间和条件应根据实际情况确定，以确保模拟消化的真实性和可靠性。
滴定叶酸：经过模拟消化后，取出样品，用缓冲液调整pH值，然后用氢氧化钠溶液或氢氧化钠-氢氧化钾混合溶液中和样品中的酸。
最后用紫外分光光度计或高效液相色谱法测定样品中的叶酸含量。
计算叶酸溶出度：将样品中经过消化后的叶酸含量与样品中加入的叶酸总量进行比较，计算叶酸溶出度。
通过叶酸溶出度方法，可以评估食品或饮料中叶酸的稳定性和生物利用度，为食品或饮料加工及生产提供科学依据。
叶酸化学发光法
叶酸化学发光法叶酸是一种维生素B群中的重要成员，对人体的生长和健康起着至关重要的作用。
叶酸的检测在医学、食品安全和环境监测等领域具有重要意义。
其中，叶酸的化学发光法在叶酸检测中得到了广泛的应用。
化学发光法是利用物质的化学反应产生光信号的方法，通过测量产生的光信号来分析目标物质的含量。
叶酸的化学发光法基于叶酸与某些试剂发生特定的化学反应，生成发光物质，再通过光信号的测量来确定叶酸的含量。
叶酸化学发光法的原理是通过酶促反应将叶酸转化为二氢叶酸，然后再与特定的试剂发生化学反应，产生发光物质。
具体而言，叶酸首先与叶酸还原酶反应生成二氢叶酸，再与酶促反应中的辅酶NADPH反应生成NADP+，同时伴随着光信号的发射。
这个光信号可以通过光电倍增管等光学器件进行测量，得到叶酸的含量。
叶酸化学发光法具有快速、灵敏和高选择性的特点。
相比于传统的光谱法、电化学法等，叶酸化学发光法具有更高的检测灵敏度和更低的检出限。
另外，叶酸化学发光法不受样品基质的影响，适用范围广泛，可以用于各种样品的叶酸含量检测，包括食品、药物、血液等。
在食品安全领域，叶酸化学发光法可以用于检测食品中的叶酸含量，帮助人们了解食物的营养价值和安全性。
在医学领域，叶酸化学发光法可以用于血液中叶酸的检测，帮助医生判断患者是否存在叶酸缺乏或过多的情况。
此外，叶酸化学发光法还可以用于环境监测中，例如检测土壤和水体中的叶酸含量，评估环境的污染程度。
虽然叶酸化学发光法在叶酸检测中具有许多优势，但也存在一些局限性。
首先，叶酸化学发光法需要使用特定的试剂和仪器设备，成本较高。
其次，该方法对样品中的其他物质可能会产生干扰，影响检测结果的准确性。
此外，叶酸化学发光法对光信号的测量要求较高，需要使用高灵敏度的光学器件来进行测量。
叶酸化学发光法作为一种快速、灵敏和高选择性的叶酸检测方法，在医学、食品安全和环境监测等领域具有重要的应用价值。
随着科学技术的不断进步，叶酸化学发光法将进一步完善和发展，为叶酸检测提供更加可靠和准确的方法。
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中南大学食品分析课程论文题目：食品中叶酸的测定方法学生姓名：毛慧悦所在学院：化学化工学院专业班级：应用化学1105班学生学号：1505110706指导老师: 张泰铭目录1叶酸 (1)1.1叶酸的化学结构 (1)1.2叶酸的理化性质 (1)1.3叶酸的作用效果 (2)2 果蔬中叶酸含量的测定方法 (2)2.1化学发光测定法 (2)2.2离子捕获法 (3)2.3F ENTON试剂氧化-荧光分析法 (3)2.4催化氧化荧光法 (3)2.5衍生荧光法 (4)2.6间接原子吸收光谱法 (4)3 保健品中叶酸的测定方法 (5)3.1铽一环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法 (5)3.2表面等离子共振技术（SPR） (5)3.3高效液相色谱法（HPLC）法 (5)3.4高分离度快速液相色谱法（RRLC） (6)3.5氨基硅油修饰碳糊电极阳极伏安法 (6)3.6发光免疫法 (7)3.7PEI修饰的量子点作为叶酸荧光探针 (7)4结论与展望 (7)4.1结论 (7)4.2展望 (8)食品中叶酸的测定方法毛慧悦（中南大学，湖南长沙 410012）摘要：叶酸，又称为维生素B9，是维生素B9的水溶形式。
叶酸是一种重要的一碳载体，在核苷酸合成等重要生理代谢功能方面有非常重要的作用。
因此叶酸在细胞分裂和生长过程（如婴儿发育、怀孕）中有着重要的作用。
叶酸的检测已成为食品研究中的热点，本文从叶酸的结构和检测几个方面展开研究，并重点阐述了果蔬和保健品中叶酸的几种测定方法。
关键词：叶酸；测定方法；果蔬；保健品Testing of folic acid in foodsMAO Hui-yue（Central South University，Hunan Changsha 410012，China）Abstract:Folic acid, also known as vitamin B9 or B c, a water-soluble form of vitamin B9. Folic acid is an important one-carbon carrier in nucleotide synthesis, metabolism of many important physiological functions of homocysteine re methylation plays an important role. Therefore, there is a particularly important role of folic acid in the rapid cell division and growth (such as infant development, pregnancy) in. Folic acid food testing has become a hot research paper from the structure, preparation of folic acid, extraction and detection aspects of a study, and focuses on the determination of several fruits and vegetables and health supplements of folic acid.Key words：folic acid；testing；vegetables and foods；health products.1叶酸1.1 叶酸的化学结构叶酸(Folic acid)，是维生素B9的水溶形式，也被称为蝶酞谷氨酸。
叶酸在人体中的含量虽然不多，但是却是人类生理活动必不可少的。
具有促进泌乳、美肤黑发和防治口腔溃疡的功效，天然叶酸存在于绿叶果蔬和动物肉蛋奶、肝脏中[1]。
叶酸主要是作为甲基供体参与甲基化反应与去氧核糖核酸的合成，它是不能被直接利用的，是要通过连续的活化反应后才能发挥其生理功能，缺乏叶酸将会引起人体异常[2]。
叶酸是由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸连结而成，即由a-氨基一4-羟基蝶啶与对氨基苯甲酸相连，然后以-NH-CO-键与谷氨酸连接而成[1]。
结构式如图一。
图一叶酸的结构式1.2 叶酸的理化性质叶酸是一种晶体，对热不稳定，将其放在两百度左右的环境中会被分解。
叶酸溶于碱溶剂，但对于许多有机溶液而言均不溶。
叶酸在碱性环境下比在溶液呈酸性的环境下要稳定的多。
溶液的酸度低于5左右时非常不稳定，叶酸在此环境下物质结构会被分解。
叶酸对光不稳定，见光易被分解，尤其容易被紫外线所破坏，常温下保存也会引起损失，因此叶酸要处在密封、避光和低温的环境中保存[3]。
1.3 叶酸的作用效果从许多研究报道看来，叶酸最主要的作用是体现在孕妇与胎儿的健康方面，贫血是孕妇和胎儿很容易发生的病症，研究表明，这种情况下的贫血一般来说是缺乏叶酸所致，病因通常被认为是在生成叶酸辅酶的过程中某种未知物质的代谢不足。
正在发育的胎儿对于母体的营养物质的要求非常高，其中一点是要有大量的叶酸在母体中储存。
但许多情况下孕妇在怀孕初期，由于孕吐导致进食过少甚至厌食就很容易引起孕妇体内缺乏叶酸的储存，这对胎儿和孕妇的健康十分不利。
叶酸在孕期存储不足就会导致在孕妇临产或产后早期，叶酸非常容易被耗尽的情况，叶酸储存耗尽极易引起妊娠毒血症或巨红细胞性贫血等病症。
另外，叶酸缺乏对于新生儿而言是一个较为严重的问题，轻则肠胃不适，重则发育迟缓。
新生儿的神经系统发育等，都与叶酸的缺乏有着不可避免的关系。
有实验表明，叶酸缺乏也会导致胃肠功能障碍、神经系统疾病甚至癌症的产生。
叶酸的缺乏会导致许多疾病产生，但体内叶酸含量的过量也会不利于健康。
如果摄入量过高会慢慢地改变人类的基因组成，导致后代对于某些致命性疾病的抵抗力减弱[4]。
2 果蔬中叶酸含量的测定方法2.1 化学发光测定法化学发光法种类较多，有液相发光和气相发光，后来技术改进后又发明了生物发光。
科学家发现化学发光也可与许多先进技术联用，如与分子印迹技术的联用，与毛细管电泳法和低压离子色谱的联用等[5]。
化学发光的原理比较简单，是指在化学反应中，反应物或其他可接受能量的物质，吸收反应过程中产生的化学能，被激发而处于激发态，回到基态时产生一定频率的光波辐射，这就是化学发光。
化学发光法相较于其他测定叶酸含量的方法而言灵敏度高、重现性好并且操作简单等显著优点。
这种方法比较适用于对含叶酸浓度较低的果蔬的检测，因为其灵敏度高，检测的结构也较其他方法更为准确。
2.2 离子捕获法离子捕获法的原理是要将样品中的叶酸变成游离态，可以在样品中加入脂肪胺聚氧乙烯醚，之后叶酸与结合蛋白分离，叶酸与亲核基团结合，最后与改性涤纶纤维结合，最后定量分析样品中叶酸的含量，即质量分数[4]。
从离子捕获法的原理来看，该法的绝对优势在于其既可以定性，还可以定量，对于尚无标准样品的未知叶酸含量的果蔬而言，是非常适合的方法。
2.3 Fenton试剂氧化-荧光分析法Fenton试剂是化学家Fenton首次发现的，所以被命名为芬顿试剂。
这种试剂是一种混合试剂，包含双氧水与亚铁离子，氧化能力很强。
许多有机化合物都能被氧化，氧化效果明显。
氧化机理比较复杂，首先是过氧化氢与亚铁离子反应生成游离的·OH和氢氧根离子，与有机物反应而消耗掉了·OH。
通过填充未饱和的C - C键，羟基无选择性地与有机物迅速反应。
同时，研究表明Fenton试剂具有一定的絮凝沉淀功能。
Fenton试剂是一种极强的氧化剂，可用于叶酸的测定，叶酸能被Fenton试剂反应产生的自由基可将氧化，叶酸被氧化成蝶啶-6-羧酸荧光强度大大增强，更易于检测[6]。
2.4 催化氧化荧光法催化氧化荧光法中要求在PH为5的酸性介质（多为醋酸-醋酸钠缓冲对）中和80摄氏度左右的水浴加热的环境中进行，钴离子直接催化KIO氧化叶酸使其生成氧化产物蝶啶-6-羧酸，使其发出荧光，在实验过程中了解到反应需要较长的时间，但是当体系中加入钴离子之后，反应的速率曲线明确表明反应速度显著加快，而且荧光强度大大增大，更易被检测。
从反应的光谱形状来看，由于形状并没有改变，所以认定钴离子在反应体系中只起到了催化作用，并没有影响到物质的化学结构[7]。
2.5 衍生荧光法前文有介绍叶酸的结构，可以知道叶酸的共扼性不强，荧光较弱。
溶液呈酸性条件和光照条件下叶酸容易被破坏，极不稳定。
衍生荧光法需要破坏叶酸的肽胺键，使叶酸生成荧光强度更大的蝶啶-6-羧酸。
前文亦有介绍在酸性条件下叶酸不稳定。
所以我们在PH低于5的情况下氧化叶酸，并用紫外光线照射样品。
实验发现叶酸的荧光很弱，线性范围非常窄，而氧化后紫外光照衍生荧光法的方法有很高的灵敏度。
经过酸性介质和强氧化剂氧化剂紫外光照射处理后产生的氧化产物荧光强度增强，使样品灵敏度提高了两到三个数量级[8]。
2.6 间接原子吸收光谱法原子吸收光谱法的原理是利用气态原子吸收特定波长的光辐射，使原子中外层的电子从基态跃迁到激发态的现象的一种检测方法[9]。
不同电子能级跃迁吸收的光的频率不同，释放能量产生的光波长也就会不同，根据释放出的光的频率和波长的测定可以对元素定性，也可以通过测定释放的光波的强度测定样品中待测组分的含量。
适用对样品的痕量组分的分析。
查资料已知叶酸在碱度环境下比较稳定，间接原子吸收光谱法是在一定的碱度下，使叶酸与镁离子反应完全沉淀，然后测定清液含量。
首先将果蔬样品中的叶酸溶于Na2CO3溶液中，经过超声振荡后离心分离提取，调节溶液为一定的碱度，并加入一百毫克每升的镁离子溶液，使其充分反应后沉淀，然后吸取离心后的上层清液里的镁离子浓度，间接计算得到叶酸的含量。
间接原子吸收光谱法方过程简单、测定快速、干扰小、灵敏度高而且精密度好，非常适用于测定果蔬中的叶酸含量的分析。
3 保健品中叶酸的测定方法3.1铽一环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法就目前所知的叶酸的检测方法有许多都存在这各自的缺陷，比如紫外光谱法测定叶酸的干扰多，某些荧光法的重现性差。
将叶酸分子作为整体进行荧光分析的方法，还没有产生，基本上所有的方法都破坏了叶酸分子的结构。
铽一环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法利用铽与环丙沙星反应的产物能产生“稀土敏化荧光”铽的特征峰，之后加入叶酸可碎灭铽与环丙沙星反应体系在某波长的特征荧光。
在这种原理上建立的荧光法保全了叶酸分子结构的完整性[10]。
3.2 表面等离子共振技术（SPR）表面等离子体共振技术试最近快速发展的新型检测技术，这种原理制造的生物传感器可以实时检测分子之间的作用，而且测量结果十分准确，不用对样品分子，即叶酸进行标记。
表面等离子共振技术，是一种快速定量测定保健品中叶酸的方法。