掌握细菌的简单染色法
细菌一般染色方法
细菌一般染色方法细菌染色是一种常用的实验技术，通过染色使细菌在显微镜下能够更清晰地观察和分析。
细菌染色通常分为简单染色、阴性染色和阳性染色三种方法。
一、简单染色方法：简单染色是最基础的细菌染色方法，主要是用一种染色剂来染色所有类型的细菌。
常用的染色剂有墨汁、甲基蓝、伊红等。
简单染色的步骤如下：1.取一片细菌涂片，将其干燥。
2.在涂片上滴加染色剂，覆盖整个片面。
3.将染色剂置于片上一分钟，用水冲洗。
4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。
5.镶片并观察。
简单染色可以使细菌呈现出斑点或条纹状，并能够区分一些基本形态和结构，但不能提供更多细菌信息。
二、阴性染色方法：阴性染色可使细菌显现为透明，而背景呈色的方法。
常用的阴性染色剂有阿里兹红、印度墨等。
阴性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上，使其成薄层。
2.滴加阴性染色剂到涂片上，使其均匀覆盖涂片表面。
3.用水冲洗染色液，并用纸巾擦干涂片。
4.镶片并观察。
阴性染色使背景呈色，使细菌透明，从而可以更清晰地观察其形态特征。
三、阳性染色方法：阳性染色可以使细菌显现为有色的圆点或杆状，常用的阳性染色剂有甲基蓝、伊红等。
阳性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上。
2.将染色剂滴加到涂片上，使其完全覆盖涂片。
3.置片5-10分钟，然后用水冲洗染色剂。
4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。
5.镶片并观察。
阳性染色可以染色细菌，使其呈现有色的形态，便于观察和鉴定。
此外，还有一些特殊染色方法，如革兰氏染色法、氢酒精酸快速染色法等。
革兰氏染色是一种经典的细菌染色方法，通过不同细菌细胞壁的染色性质来将其分为革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。
该方法使用革兰紫染色剂和碘液，以及酒精和碳酸盐条件溶液进行染色处理。
氢酒精酸快速染色法是一种常用的快速染色方法，将细菌用甲基蓝染色液处理一段时间后，用酒精和酸性酒精进行洗涤和脱色，最后用伊红染色液着色。
这种方法可以快速地将细菌分为两种主要类型：革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
细菌的简单染色与革兰氏染色
三、实验器材
1、菌种 培养12-16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养 24小结晶紫、革兰氏碘液、95%乙醇、蕃红、 复红、二甲苯、香柏油 3、器材 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜 纸、显微镜等。
实验四 细菌的简单染色与革兰氏染色
一、目的要求
1、学习细菌染色的原理和方法； 2、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
二、基本原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料 和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷， 能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点 较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中 时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、 结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性 染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所 带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果 红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物 又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
肉毒芽孢杆菌
杆菌
变形杆菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
四、实验方法及步骤
1、简单染色
（1）涂片 取干净载玻片一块，在载玻片的左、 右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片， 左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓 菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金 杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面， 将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄 涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意 取菌不要太多。
六 实验报告
1、结果 （1） 绘制简单染色的细菌个体形态图； （2） 绘制Bacillus subtilis和Escherichia coli 的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反 应性。 2、思考题 当对未知菌进行革兰氏染色时，如何保证 操作正确及结果可靠？
02-实验三、细菌简单染色
三、操作步骤
（一）细菌的简单于玻片中央，用接种环 以无菌操作从金黄色葡萄球菌平板上挑取少许菌苔于水滴中， 混匀成薄膜。
载玻片无油迹；滴蒸馏水不要太多；涂片要涂抹均匀
2.干燥 室温自然干燥
3.固定 涂面朝上，通过火焰2-3次，热固定温度不宜过高，以免 改变或破坏细胞形态。 4.染色 滴加石炭酸复红染液或吕氏碱性美蓝染液于涂片上，染色 约1-2分钟
实验三、细菌的简单染色
一、实验目的与要求
1 .学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简 单染色的方法 2 .掌握油镜的使用方法和无菌操作技术
二、器材
1.菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 2.染色剂：石炭酸复红染液或吕氏碱性美蓝染液 3.仪器及其他用具 显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 香柏油 二甲苯 擦镜纸 蒸馏水
5.水洗 用自来水冲洗，直至涂片上流下的水为无色为止。
Note:不要直接冲洗涂面，使水从载玻片的一端流下。
水流不宜过大，以免涂片薄膜脱落
6.干燥 自然干燥或用吸水纸吸干
7.镜检 涂片必须完全干燥后才能依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察
结果要画出形态图
细菌简单染色法.
简单染色微生物染色原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
使用草酸铵结晶紫染色液，染色迅速，着色深，菌体呈紫色。
步骤1、涂片1.取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水；2.用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔；3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2、干燥将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。
也可用电吹风低温吹干。
3、固定手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。
原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4、染色将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。
染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min；草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。
注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。
水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥自然干燥：平放于室温，自然干燥；吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。
配方1、吕氏碱性美蓝染液溶液A 美蓝0.6克；95%乙醇30毫升溶液B 氢氧化钾0.01克；蒸馏水100毫升分别配制溶液A和B 配好后混合即可。
实验二、细菌的简单染色与革兰氏染色
2、掌握好乙醇脱色时间。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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葡萄球菌
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杆菌
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五、实验数据及处理结果
1、根据油镜观察结果，绘出普通变形杆菌和表皮 葡萄球菌的简单染色形态图。 2、列表简述普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的革兰 氏染色油镜观察结果（菌的形态、颜色、革兰氏染 色反应）。
G-菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖 分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙， 细胞透性增大，结晶紫－碘复合物易被洗脱出来，再经 番红复染后使细胞显红色。
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三、实验器材
1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌 2、染色剂：简单染色液(吕氏碱性美蓝染液)；革兰氏 染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、 番红染液） 3、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、接 种环、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、滤纸等
细菌产酸使培养基pH下降时，细菌带正电荷增
加，可采用酸性染料。酸性染料有：伊红、酸性复
红、刚果红等。
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2、革兰氏染色
革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色， 初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。
G＋菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂， 肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网 孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫 －碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。
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四、操作步骤
1、简单染色
涂片
加热干燥固定
染色 1min 水洗
干燥
镜检
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验三简单染色法和革兰氏染色法
实验三简单染色法和革兰氏染色法实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能1.2学习微生物涂片、染色的基本技术1.3掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2 实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
一般使用碱性染料进行简单染色。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
3实验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染液，番红染液。
3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。
4 流程涂片干燥固定染色水洗干燥镜检5 步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸馏水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
细菌的简单染色和革兰氏染色
（三）实验设备
1、活材料： 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 大肠杆菌（Escherichia coli） 2、染色液和试剂：
结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复 红、二甲苯、香柏油
（四）实验步骤与内容
1、简单染色：
（1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）染色 （5）水洗 （6）干燥 （7）镜检
细菌的简单染色和革兰氏染色
(一) 实验目的要求
1、学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。 2、掌握葛兰氏染色法的基本原理及其在细菌分
类学上的重要性。
（二）基本原理
1、用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性 染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电 荷，能和带负电荷的物质结合。 2、革兰氏染色法所以能将细菌分为G+菌和G— 菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所 决定的。
2、革兰氏染色
1．制片 2．初染 3．媒染 4．脱色（关键） 5．复染 6．镜检 7．混合涂片染色
革兰氏染色程序
金黄色葡萄球菌的革兰氏染色照片
大肠杆菌的革兰氏染色照片
革兰氏染色照片
球菌
葡萄球菌
大肠杆菌
巨噬Байду номын сангаас胞在攻击大肠杆菌
（五）实验报告
1、结果 列表简述3株细菌的染色观察结果(说明各菌的形状、颜 色和革兰氏染色反应)。 2、思考 （1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？ 其中最关键的环节是什么？ (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌， 请你鉴定其革兰氏染色反应．你怎样运用大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染 色结果正确性．
实训四 细菌的染色和形态观察
实训四细菌的染色与形态观察一、实验目的1、学习细菌涂片技术和无菌操作技术；2、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征；3、了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法；4、进一步熟练显微镜的使用。
二、实验原理细菌个体微小，无色且较透明，折射率低，在普通光学显微镜下不易识别，因此必须借助染色法使菌体着色，将其折射率增大，使其与背景形成明显的色差，在显微镜下用油镜观察，可清楚观察到细菌的一般形态结构及特殊结构。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可用简单染色法或革兰氏染色法进行染色观察。
（一）简单染色法简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料进行细菌染色的方法。
此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察，但不能辨别细胞的构造。
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使其着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用的简单染色染料有草酸铵结晶紫染液、吕氏碱性美蓝（亚甲基蓝）、石炭酸复红染液等。
（二）革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学上最重要的鉴别染色法。
由于细菌细胞壁的化学组成和结构不同，经革兰氏染色后，呈现不同的染色反应，可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阳性细菌（染色反应呈蓝紫色），用G+表示；革兰氏阴性细菌（染色反应呈红色），用G-表示。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，脂类含量低。
在染色过程中，用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色。
革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，脂溶剂乙醇溶解脂类物质，使得细胞壁的通透性增加，结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
细菌的简单染色和革兰染色
实验三细菌的简单染色和革兰染色一．实验目的1．学习并熟练局部无菌操作2. 学习细菌涂片的制法，掌握细菌简单染色和革兰氏染色的方法3. 进一步熟悉显微镜的使用。
二．实验原理细菌生长时常带负电，所以常用带正电的碱性染料染色。
简单染色就是用一种染料染色的方法。
革兰氏染色可把细菌根据细胞壁成分和结构分为阳性和阴性，阳性菌细胞壁中脂类物质多，染色为紫色；阴性菌细胞壁中脂类物质少，染色为红色。
三．实验材料、仪器与试剂1.菌种：金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌、未知菌，酵母。
2.仪器用品：显微镜、载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，火柴，镊子，擦镜液，吸水纸，牙签3.试剂：简单染液：草酸铵甲紫染液，蕃红染液革兰氏染液：1) 草酸铵甲紫染液；2) 革氏碘液；3) 脱色液；4) 蕃红染液实验前准备（助教完成）将菌种培育24h。
四．实验步骤（一）简单染色1.取载玻片用纱布擦干，在涂菌面反面画直径2mm左右的小圈，把涂菌部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2.涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从EP管中沾取菌液一滴，在洁净无脂的载玻片上涂涂膜。
取菌过程要在酒精灯附近的无菌环境中进行。
3.晾干：让涂片自然晾干。
4.固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5.染色：将固定过的涂片放吸水纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6.水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液7.镜检。
（二）革兰染色。
1.制片：取菌液制成涂片：干燥，固定。
2.初染：滴加1滴结晶紫色染液，1min，水洗。
3.媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
4.脱色：吸去残留水，滴加脱色液至流出液无紫色，立即水洗。
5.复染：滴加蕃红复染3min，水洗。
6.镜检：用吸水纸吸干，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。
注意细菌形态、大小、排列、颜色。
7.拍照。
（三）选做实验往干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片，革兰染色。
细菌的简单染色法和革兰氏染色法
细菌的简单染色法和革兰氏染色法1细菌的简单染色法和革兰氏染色法陈慧霞食品13102班0201一引言1.学习并掌握细菌简单染色法的原理和方法。
2. 掌握革兰氏染色法的原理和操作技术,进一步巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。
二实验原理1.简单染色法用单一染料进行细菌染色,操作简便,适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
一般情况下,细菌细胞通常带负电荷,易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。
因此,常用碱性染料进行简单染色。
常见的碱性染料有亚甲蓝、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和番红等。
2.革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
革兰氏染色的原理主要是因为两类细菌的细胞壁成分和结构不同。
革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了番红的颜色,因此呈现红色。
而革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖的含量多且交联度大,类脂质含量少,当用乙醇处理时,肽聚糖层的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易着色,因此,细胞仍保留初染时的颜色即呈现紫色。
细菌先经碱性染料结晶紫染色,再经碘液媒染(以增加染料与细胞的亲和力)后,用乙醇脱色,再用番红染色。
不被脱色而保持原颜色者为革兰氏阳性菌(G+);被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阴性菌(G-)。
三实验材料1简单染色法菌种:枯草芽孢杆菌试剂与器材:复红,接种环,酒精灯,打火机,载玻片,吸水纸。
2革兰氏染色法菌种:大肠杆菌,金黄色葡萄球菌染液:结晶紫染液,碘液,95%乙醇,番红染液,香柏。
器材和试剂:洗净的载玻片,显微镜,酒精灯,接种环,擦镜纸,吸水纸,镊子,玻璃废液缸,蒸馏水等。
四实验步骤1.无菌操作:1.关闭窗户和风扇2.用酒精棉双手表面消毒3.接种环取菌前后焚烧灭菌4.棉塞靠近火焰不离手5.实验在酒精灯附近进行6.少说话2.简单染色法:●准备玻片:取清洁干净的载玻片。
实验二细菌的简单染色与革兰氏染色
通过显微镜观察，判断细菌是否着色，从而初步判断细菌的种类。
了解革兰氏染色的原理和操作方法
了解革兰氏染色的原理
了解染色结果
通过使用两种不同的染料，使细菌呈 现不同的颜色，从而区分革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌。
通过显微镜观察，判断细菌是否被染 色以及呈现的颜色，从而确定细菌的 革兰氏类型。
革兰氏染色的目的是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因为这两种类 型的细菌在染色结果上存在明显的差异。
03 实验材料
菌种察。
金黄色葡萄球菌
另一种常见的细菌样本，具有不 同的染色特性。
染色液
结晶紫染色液
用于细菌的简单染色。
革兰氏染色液
用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
简单染色的原理是利用染料对细菌的亲和力不同，将细菌染成不同的颜色，从而区 分不同类型的细菌。
简单染色方法简便、快速，但染色效果不如革兰氏染色。
革兰氏染色原理
革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过使用结晶紫、碘液和酒精 等染料对细菌进行染色。
革兰氏染色的原理是利用结晶紫和碘液对细菌的亲和力不同，将细菌染 成紫色或红色，再通过脱色剂酒精将细菌脱色，最后用番红和碘液复染。
其他试剂和器材
显微镜
用于观察染色后的 细菌。
酒精灯和接种环
用于加热染色液和 接种细菌样本。
无菌水
用于清洗玻片和细 菌样本。
载玻片和盖玻片
用于放置和观察细 菌样本。
吸管和滴管
用于吸取染色液和 其他试剂。
04 实验步骤
细菌的简单染色
01
02
03
涂片制作
将细菌均匀涂在载玻片上， 晾干后进行染色。
染色
出细菌的细胞壁结构特点。
细菌概述 细菌的简单染色
谢谢大家！
光学显微镜下的状态
细菌芽孢的各种类型
3、鞭毛染色和运动观察
基本原理：在染色前先用媒染剂（如单宁酸或者明 矾钾）处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛的直径 变粗，然后再进行染色（如硝酸银或者结晶紫）
运动观察：压滴法、悬滴法
4、荚膜染色法：
基本原理：由于荚膜与染料之间的亲和力较低，不易 着色，通常采用负染法染荚膜，使菌体和背景着色而荚 膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚 膜的含水量在90%以上，染色时一般不加热固定，以免 荚膜皱：芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因 此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件 下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以 进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽 孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如番红） 染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成 复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易 于区分。
基本原理： 细胞含水量在70%-90%，易与背景融为一体。
经过染色就可借助颜色的反衬作用清楚的看 清菌体形态。还可以通过不同的染色反应来 鉴别微生物的类型，区分死、活细菌等。
1、革兰氏染色：细菌分类和鉴定的依据
原理：G+菌肽聚糖含量较高，网状结构致密 G-菌肽聚糖含量较低，含有一定脂类，结构疏
松。 步骤：涂片→干燥、固定→初染→媒染→脱色→复
细菌的常用染色技术
细菌的常用染色技术简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
例如番红。
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。
例如革兰氏染色法。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。
碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。
1.载玻片固定。
在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。
2.草酸铵结晶紫染1分钟。
3.自来水冲洗，去掉浮色。
4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。
5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。
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思考题
简单染色:
(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大扬杆菌
和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 (3) 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
思考题
荚膜染色法: (1) 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？
芽孢染色法: (1) 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?
操作步骤（continued）
4、染色
操作步骤（continued）
◇ 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 ◇ 美蓝染色1-2min；石碳酸复红染色约1min。
5、水洗
倒去染液，用洗瓶（内装自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止；染色废液收集在废液缸中。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+）和 革兰氏阳性（G-）
革兰氏染色步骤: 1）结晶紫初染；2）碘液媒染； 3）酒精脱色； 4）番红复染
实验原理
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性 屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故 保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
思考题
芽孢染色法 (1) 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢? (2) 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？
本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！
下次实验再见！
谢谢观赏
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3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二甲 苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
2、革兰氏染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构 造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。 常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红 等酸性染料染色。
实验材料 1、菌种
枯草芽孢杆菌12～18h培养物 金黄色葡萄球菌24h培养物
2、染色剂 吕氏碱性美蓝染液 齐氏石碳酸复红染液
四、实验步骤
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使 其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加 大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈 红色。
细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体
实验材料 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（2d）、胶质芽胞杆菌 革兰氏染色液一套
6、干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。
操作步骤（continued）
7、镜检（continued）
操作步骤（continued）
Notes: 1) 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油 2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头
后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染3分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
Figure 2 - Gram stain of Gram – E. coli cells
掌握细菌的简单染色法
1
实验目的
1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 2、初步认识细菌的形态特征。 3、学习细菌的革兰氏染色原理和方法 4 、了解细菌的特殊形态结构：
芽孢、荚膜的染色 5、学习训练无菌操作技术。
1 细菌的简单染色
实验原理
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。
实验步骤
革兰氏染色 枯草杆菌的芽孢染色 荚膜的染色 绘图、写实验报告
革兰氏染色的步骤
1. 涂片 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，
倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂
面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，
简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱 性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌 着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
涂片 干燥 固定
染色
无菌操作
水洗 干燥 镜检
操作步骤
1、涂片
操作步骤（continued）
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无 菌操作从枯草杆菌（1d）斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。
如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。
3 枯草杆菌芽孢的染色
1、制备菌液：加2-4滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体4环于试管中 充分混匀。 2、加染色液：加孔雀绿3滴于1.5ml 离心管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从离心管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。 7、复染：加复红染色1-2分钟。水洗，吸水纸吸干。 ８、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。
4细菌荚膜的染色
负染色法： 1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，取
少量的菌体放入墨水滴中混匀并涂片。 2、刮片：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入
黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。 3、镜检：10x ，40x 物镜观察（注意物镜不要接
触黑素，不要用油镜观察）
荚膜
本实验安排 每人
➢ 简单染色：枯草芽孢（1d）。 ➢ 革兰氏染色：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、本人斜面菌株。 ➢ 荚膜染色：胶质芽孢杆菌。 ➢ 芽孢染色：枯草芽孢（2d）
Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过 厚。
操作步骤（continued）
菌悬液
涂片
干燥
滴加无菌水
取菌苔
涂片
固定
2、干燥 室温自然干燥
3、固定
固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态