极大螺旋藻多糖的分离纯化及化学结构分析_邓时锋

第36卷第5期2000年9月
南京大学学报(自然科学)
JOURNAL OF NANJING UNIVERSIT Y
(NATU RAL SCIENCES)
Vol.36,No.5
Sept.,2000
文章编号:0469-5097(2000)05-0579-06
极大螺旋藻多糖的分离纯化及化学结构分析*
邓时锋,刘志礼,李兆兰,喻利
(南京大学生物科学与技术系,江苏南京210093)
摘要:极大螺旋藻干粉经热水提取、醇析、Sevag法脱蛋白得粗多糖,经Sephadex G-100凝胶
柱层析得白色粉末状多糖纯品(P olysaccharide of Spirulina max ima,PSM).纸层析、凝胶柱层析、高效液相色谱分析表明为均一组分.硫酸-咔唑法、硅胶薄层层析和气相色谱分析表明PSM是
一种由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖和葡萄糖醛酸组成的酸性
杂多糖,其摩尔比为1.947B0.905:1B1.182B0.338B0.347B1.330.高碘酸氧化和Smith降解表
明该多糖中主要含有1y3位和1y6位键合的糖苷键,其主链由L-鼠李糖以1y3位键合的糖
苷键组成.红外光谱分析和核磁共振氢谱分析表明其糖苷键键型为A型.Sephadex G-200凝胶柱
层析表明其分子量约为2.95万.
关键词:螺旋藻多糖;分离纯化;结构测定
中图分类号:Q946.3文献标识码:A
极大螺旋藻(Sp ir ulina max ima Setch.et Gacdn)是一种多细胞丝状蓝藻,属蓝藻门、颤藻目、螺旋藻属,是一种重要的营养和药物资源.近年来,随着糖科学和糖技术的发展,藻类多糖与其它多糖一样,在作为医药产品方面已日益为人们所重视.如钝顶螺旋藻多糖能够提高机体免疫功能[1],能够增强小鼠骨髓细胞增殖能力,减轻小鼠细胞的辐射遗传损伤[2],并能明显抑制体内移植性癌细胞的增殖[3];极大螺旋藻多糖能明显抑制人血癌细胞的生长[4].本文从工业生产的极大螺旋藻干粉中提取、分离、纯化获得PSM纯品,并对其单糖组成、连接方式、糖苷键键型以及分子量等作了较深入的分析.
1材料与方法
标准多糖Dex tran T-10、40、70、100、2000(蓝色葡聚糖)均为Sigma公司产品,其余试剂均为国产分析纯试剂.极大螺旋藻粉由江苏常熟生物制品厂提供.
1.1提取螺旋藻粉经ZK高速自控组织捣碎机破壁处理,镜检无螺旋状藻体存在.加入10倍体积的蒸馏水,70e保温提取24h,离心,上清液浓缩后加入3倍体积95%乙醇醇析.
1.2分离纯化
1.2.1小分子杂质及蛋白质的去除粗多糖溶于水中,Sevag法脱蛋白,考马斯亮兰检测为阴性.流水透析2d,蒸馏水透析过夜,浓缩至小体积,加入3倍体积95%乙醇醇析.
1.2.2Sephadex G-100凝胶柱层析凝胶柱为70cm@2.6cm,0.1mol/L NaCl洗脱,每管4m L,硫酸-苯酚法检测.
*收稿日期:1999-06-18
作者简介:邓时锋,男,1976年生,南京大学生物系98级硕士研究生.
1.3 纯度鉴定[5]
1.3.1 纸层析(PC) 新华中速滤纸(3.5cm @30cm),点样,饱和2h,室温展层6h,展层剂为正丁醇:浓氨水:水(40:50:5),0.5%甲苯氨蓝乙醇液染色,95%乙醇漂洗至背景褪色.1.3.2 凝胶柱层析 Sephadex G -200柱层析(35cm @
2.6cm),流速7.5mL/h,0.1mol/L NaCl 洗脱,每管2.5mL 硫酸-苯酚法检测.
1.3.3 高效液相色谱分析(H PLC) Waters 600E 高效液相色谱仪,TSK3000GW 层析柱(7.5mm @300mm ),洗脱液为H 2O,流速为0.7m L/m in,示差折射仪检测.
1.4 紫外光谱分析(UV) PSM 溶液(2m g/mL)经日立U -3000紫外分光光度计于200nm ~400nm 扫描.
1.5 糖苷键键型分析
[5]
1.5.1 红外光谱分析 PSM 经KBr 压片,经NICOLET 170SFT 型红外光谱仪分析,扫描范围为4000~650cm -1.
1.5.2 核磁共振氢谱分析 PSM 在BRUKER AM -500MH z 核磁共振仪上进行分析,溶剂为重水(D 2O),参考标准为四甲基硅烷(TM S).
1.6 单糖组成分析
[5,6,7]1.6.1 硅胶薄层层析 0.5%CMC 溶液和0.1mol/L NaH 2PO 4的溶液调制硅胶H 薄板,105e 活化30min.取PSM 10mg ,加入3m L 2mol/L 的H 2SO 4封管100e 水解6h,碳酸钡中和,浓缩点样,展层剂为正丁醇:冰醋酸:水(4:1:5),苯胺-邻苯二甲酸试剂显色,与相应的标准品对照.
1.6.2 硫酸-咔唑反应 采用Dische 法测定
.
图1 PSM 的高效液相色谱图Fig.1 C hrom atography of HPLC of PSM
1.6.3 气相色谱分析 取PSM 10mg,加入3mL 2mol/L 的三氟乙酸,封管100e 水解6h,减压抽干,加入3mL 甲醇,减压抽干(共3次),加入10mg 盐酸羟胺,0.5m L 吡啶,90e 水浴反应30min,取出冷至室温,加入0.5mL 乙酸酐,90e 继续反应30min,产物直接进行气相色谱分析,标准单糖经同样处理作为对照.HP6890型气相色谱仪,HP -5融熔石英柱(30m @0.25m m),检测器(FID)温度300e ,载气N 2,流速1.4mL/min.
1.7 相邻单糖基连接方式的分析[5]1.7.1 高碘酸氧化 取PSM 30mg 溶于55mL 15mmol/L 的NaIO 4溶液,放置暗处(4e ),间或振荡,间隔24h 取样,稀释250倍于223nm 处测定吸光值.
1.7.2 Smith 降解 经高碘酸氧化后的多糖液约40mL,加入2mL 乙二醇,搅拌30m in,流水透析48h,蒸馏水透析过夜,浓缩至30mL,加入60
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mg NaBH 4,室温暗处搅拌还原24h,用0.1mol/L 的乙酸调节pH 至5.5,对流水透析2d,蒸馏水透析过夜,冷冻干燥得多糖醇,加入3mL 2mol/L 三氟乙酸,封管100e 水解6h,减压蒸干,加入3mL 甲醇,减压蒸干(共3次),加入20mg 盐酸羟胺,1mL 吡啶,90e 振荡反应30min,取出冷至室温,加入1mL 乙酸酐,90e 继续反应30m in,产物直接进行气相色谱分析,气相色谱条件同前.
图2 PSM 的红外光谱图
Fig.2 IR of PSM
1.8 分子量测定 凝胶柱层析法(Sephadex G -200,35cm @
2.6cm)测定其分子量.标准多糖分别上样,上样量为3mg ,流速0.2mL/min,每管2ml,0.1mol/L NaCl 洗脱,苯酚-硫酸法检测,分别求得洗脱体积(V e).蓝色葡聚糖在相同条件下上样,测定其洗脱体积(V o),以分子量对数(lg M )为横坐标,V e/V o 为纵坐标,绘制标准曲线.PSM 在相同条件下上柱,测定其洗脱体积.
2 结 果
2.1 分离纯化 极大螺旋藻粉100g 提取粗多糖,经脱蛋白、透析、凝胶柱层析,收集单一洗脱峰,透析,冷冻干燥得白色粉末状PSM 纯品840mg,纯多糖得率为0.84%.
2.2 纯度鉴定 纸层析结果为单一海蓝色斑点,
图3 PSM 的氢谱图Fig.3
1
H -NMR of PSM
凝胶柱层析和高效液相色谱分析(图1),结果均为单一对称洗脱峰,表明组分均一.2.3 紫外光谱分析 结果显示在260nm 和280nm 处无明显吸收峰,表明PSM 中不含核酸和蛋白质等杂质成分.2.4 糖苷键键型分析 2.4.1 红外光谱分析 结果表明,PSM 在3400cm -1
附近有O -H 伸缩振动的强吸收峰,2900cm -1有C -H 的伸缩振动,1400~1200cm -1有C -H 的变角振动吸收峰,839.9cm -1
处有吸收,表明PSM 为A 型糖苷键(图2).
2.4.2 核磁共振氢谱分析 结果表明,Cl 位氢主要峰的化学位移大于5.0,无明显裂分,说明PSM 为A 型糖苷键(图3).2.5 单糖组成分析
2.5.1 硅胶薄层层析 结果表明PSM 由L -鼠李糖、D -木糖、D -半乳糖、D -葡萄
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糖、D -甘露糖、葡萄糖醛酸组成,其RF 值分别为0.61、0.58、0.38、0.41、0.50、0.12.2.5.2 硫酸-咔唑反应 结果为阳性,表明PSM 单糖组成中有己糖醛酸.根据T LC 结果,以葡萄糖醛酸配制标准溶液,得回归方程y =0.00765x +0.01625,r =0.99944(n =5
).图4 硫酸-咔唑比色法标准曲线Fig.4 Standard curve of sulfuric
acid -carbazole method
测得葡萄糖醛酸含量为18.873%(图4).2.5.3 气相色谱分析 结果表明(见图5,表1),PSM 由L -鼠李糖、D -木糖、D -半乳糖、D -葡萄糖、D -甘露糖和D -阿拉伯糖组成.
表1 PSM 的气相色谱分析结果Table 1 GC analysis of PSM
R etT ime/min A rea/%L-鼠李糖
17.28834.0430D-阿拉伯糖19.126 5.91814D-木 糖19.37815.81754D-甘露糖28.911 6.07201D-葡萄糖29.07017.48596D-半乳糖
29.377
20.66611
综上所述,PSM 由L -鼠李糖、D -木糖、D -葡萄糖、D -半乳糖、D -阿拉伯糖、D -甘露糖和葡萄
1.L -rhamnose17.487;
2.D -fuctose;
3.D -arabinose;
4.D -x ylose;
5.D -mannose;
6.D -g lucose;
7.D -galax tose
图5 PSM 的气相色谱图Fig.5 GC analysis of PSM
糖醛酸组成的酸性杂多糖,其摩尔比为1.947:0.905:1:1.182:0.338:0.347:1.330.
2.6 相邻单糖基连接方式分析[5] 2.6.1 高碘酸氧化 10d 后OD 值稳定,根据NaIO 4标准曲线:y =2
3.681x -0.0323,r =0.9996(n =10),计算高碘酸钠消耗量.吸取10mL 溶液,加入1mL 乙二醇,用NaOH 溶液(0.01mol/L 的邻苯二甲酸氢钾溶液标定)滴定甲酸生成量,其关系为多糖:高碘酸钠消耗量:甲酸生成量=1:0.3891:0.1629,根据高碘酸氧化规则可知,1y 6位键合的
糖基占16.29%,1y 3位键合的糖基占
77.38%.
2.6.2 Smith 降解 气相色谱分析结果表明(见图6),降解产物中L -鼠李糖的含
量为53%,表明PSM 的主链由L -鼠李糖
以1y 3位键合的糖苷键组成.同时极少量的甘油、赤藓醇表明PSM 中含有少量的1y 2位或1y 4位糖苷键.
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1.glycerol;
2.erythritol;
3.L -r hamnose;
4.D -arabinose;
5.D -x ylose;
6.D -mannose;
7.D -gluctose;
8.D -g alaxtose
图6 Smith 降解的气相色谱图Fig.6 GC analysis of Smith degradation
2.7 分子量测定 经Sephadex G -200凝胶柱层析测得其外水体积为52mL,PSM 的洗脱体积为102mL,根据标准多糖的回归方程y =7.112- 1.157x ,测得其分子量约为2.95万.
3 讨 论
极大螺旋藻多糖成份复杂,分离纯化难度较大,由于其单糖组分较多,因此PSM 精细结构难以测定.实验中对几种脱蛋白的方法进行了比较,发现T CA 沉淀法和H Cl 等电点法效果较好,脱蛋白效率很高,但多糖损失率达38%和34%,为避免多糖降解和损失,因此还是选择较温和的Sevag 法(用氯仿:正丁醇=4:1,混合振荡),纯多糖经紫外光谱扫描表明脱蛋白质、核酸等大分子效果很理想.纸层析、凝胶柱层析和高效液相色谱分析表明纯多糖组分
均一,其中高效液相色谱图不是十分好,这可能主要是由于色谱仪稳定性和检测器灵敏度较差的缘故.气相色谱采用糖腈乙酸酯衍生法进行,每种单糖(酮糖除外)均能得到单一的色谱峰,故可根据其峰面积推断单糖的摩尔比.TLC 比GC 少检出一个阿拉伯糖,主要是因为阿拉伯糖含量较低,而TLC 的灵敏度较差所致,GC 未检出葡萄糖醛酸,主要是因为葡萄糖醛酸还原乙酰化产物仍含有羧基,极性大,在此条件下不易气化出峰.
多糖具有广泛的生物学活性,是一种天然来源的免疫调节剂,其最大的优点是毒副作用小,来源广.作为抗肿瘤药物,它可以克服肿瘤病人化疗和放疗过程中在杀死肿瘤细胞的同时造成的对机体正常细胞的损伤.因此极大螺旋藻多糖的研究具有广阔的应用前景,其药理药效方面的工作有待于进一步的深入.
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[参 考 文 献]
[1] 刘力生,郭宝江,阮继红,等:螺旋藻多糖对机体免疫功能的提高作用及其机理研究[J].海洋科学,
1991;(6):44~49.
[2] 郭宝江,庞启深,阮继红,等:螺旋藻多糖对植物细胞辐射遗传损伤的防护效应[J].植物学报,1992;
34(10):809~812.
[3] 刘力生,郭宝江,阮继红,等:螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理的研究[J].海洋科学,
1991;(5):33~37.
[4] 刘宇峰,张成武,沈海燕,等:极大螺旋藻胞内多糖对人血癌细胞生长的影响[J].中草药,1999,30
(2):115~118.
[5] 张惟杰.糖复合物生化研究技术[M ].第3版.浙江大学出版社,1994.202~206.[6] 张惟杰.复合多糖生化研究技术[M ].上海科学技术出版社,1987.294~296.[7] Staub A N.M ethods in Carbohydr [J].Chemistr y,1965,5:5.
ISOLATION,PURIFIC ATION AND CHEMICAL STRUCTURE ANALYSIS OF POLYSACCHARIDE FRO M
SPIR ULINA MAXIMA
DENG Shi -f eng,LI U Zhi -li,L I Zhao -lan,Y U li
(Department of Biological Science and T echnology,Nanjing U niversity,Nanjing,210093,China)Abstract: Polysaccharide o f Sp ir ulina max ima (PSM )w as isolated and purified from Sp ir ulina max ima by hot water extr action,alcohol precipitation,Sevag method and gel filtr atio n(Sephadex G -100).Its homog eneity w as ex amined by paper chromatography,Sephadex G -200g el column chromatography and HPL C.T he av erag e molecular weight of PSM is 29500.Infr ar ed analysis and t he 1H spectrum of nuclear magnetic resonance analysis show ed that PSM has A -glycoside linkage.I ts mono -saccharide compositio n was identified by thin -layer chromatography and GC.PSM consists of L -rhamnose,D -arabinose,D -x ylose,D -mannose,D -glucose,D -g alactose and glucuronic acid in the ratio of 1.947:0.338:0.905:1:0.347:1.182:1.330.T he results of periodate oxidation and Smith degradation showed that the major linkage of PSM is (1y 3)L -rhamnose.Key words: polysaccharide of sp ir ulina max ima ;isolation and purification;chemical str ucture analysis
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