圆二色谱技术及其应用
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（1）手性物质
含有不对称原子（结构) 的物质。具有光学活性。 一束平面偏振光进入手性分子时，手性物质会将其分解为 左右圆偏振光，并进行不同的处理。
（2）旋光现象
左右圆偏振光在手性分子中的行进（旋转）速度不同，通过 样品后，再次合成的偏振光相对于入射光旋转了一定角度。
（3）圆二色性
手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量 的振幅不同通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光， 而是椭圆偏振光。
4 光电倍增管 （PM） ５ 样品杯
由高度均匀的熔融石英制做，不会带来附加的原二色性， 也不会对光产生散射。 样品浓度要与样品杯光径配合，使待测样品的O.D.值 不大于２。
6 氮气保护装置
四 氨基酸和肽的圆二色性
（一）氨基酸的圆二色性
氨基酸分子中具有紫外生色团的有吲哚基，酚羟基，苯基，二硫键， 咪唑基，羧基。 酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，胱氨酸，脯氨酸在近紫外区（240-300nm) 对CD谱有贡献 羧基在200-210nm显示正峰。
（二）肽的的圆二色性
Secondary structure of macromolecule α-helix: 190 nm (+) 208nm, 222nm (-) β-sheet: 195nm (+) antiparallel: red shift parallel: blue shift 215-217nm (-) Unordered structure: (-) below 200nm (+) 218nm weak band [θ] x E-3
+ -
λ0
λ
3 CD与ORD和吸收光谱相比在结构分析中的优点
（1） 吸收谱均是正值，若同时存在多个吸收峰，其互相交叠， 分析困难。
（2） 对于ORD谱，任意波长处的旋光性是所有生色团贡献之和， 其极值与吸收谱不同。 （3） CD谱线可正可负，其极值与吸收谱一致。
三 旋光仪与圆二色仪
（一）圆二色仪光路图
二 基本原理
（一） 几种偏振光的概念
1 平面偏振光 （plane polarized light)
又称线偏振光(linearly polarized light) 对着光前进的方向观察时， 一束光 波的电场矢量（或磁场矢量）都是在同 一方向振动。
2 圆偏振光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋（在平面上的 投影为圆形）。 电矢量方向沿逆时针方向旋转，称为左圆偏振光 电矢量方向沿顺时针方向旋转，称为右圆偏振光
BSA 在疏水石英板表面的CD谱
（a.1ug/ml,60S; b. 5ug/ml,60S ;c .60ug/ml,60S ; d.60ug/ml,30min;e.60ug/ml,溶液中的BSA）
（5） 磷脂膜诱导的蜂毒素二级结构的变化
1α-螺旋84%，β-折叠1% 无规卷曲15% 2 α-螺旋27%，β-折叠20% 无规卷曲53%
One may find that the protein concentration needs to be adjusted to produce the best data. Changing this has a profound effect on the data, so small increments or decrements are called for. If that does not produce reasonably good data, a change in buffer composition may be necessary. It would also be a good idea to check the sample for unforeseen aggregation via Dynamic Light Scattering (DNA repair enzymes are an especially good example of this behavior). If buffer poses a problem, cells with shorter path (0.1 mm) and a correspondingly increased protein concentration and longer scan time can help.
α-helix β-sheet
0
unordered
200
210
220 230 240
nm β-turn: 180-190nm (-) 远紫外区（190-240nm) 200-205nm (+) 225nm (+) band, weak red shift
（三）含有金属离子的生色团
在波长大于300nm的区域，包括可见区域，对CD谱的贡献主要 来自像血红素一类含有金属离子的生色团，这一波段CD谱常用于研 究金属离子的氧化态、配位体以及链-链相互作用。
平面偏振光
左圆偏振光
右圆偏振光
3 椭圆偏振光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋（在平面上的
投影为椭圆形）。
4 自然光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 取所用可能方向，没有一个方向较其它方向占有优势。
（二） 几种偏振ຫໍສະໝຸດ Baidu的关系
圆二色技术及应用
一 序言 二 基本原理 三 圆二色仪 四 氨基酸和肽的圆二色性 五 圆二色技术的应用
一 序言
17世纪,Huggens,偏振光 1881年,Biot,石英能使偏振光的偏振面旋转, 1934年，Lowry, 《Optical Rotatory Power》 1953年，建立了第一台偏振光检测仪 19世纪60年代以后，圆二色仪出现
蜂毒素的CD谱
（1：蜂毒素插入单层膜的CD谱；2：蜂毒素吸附在单层膜上时的CD谱； 3：在Tris-HCL缓冲液中的蜂毒素CD谱）
t u co S
Conformational transition: from alpha-helix rich to beta-sheet rich PrPc PrPsc
五 圆二色技术的应用
1 利用圆二色谱，可以计算多肽二级结构的含量。
θ λ = f α [θ ]λ ,α + f β [θ ]λ , β + f γ [θ ]λ , γ
[θ]λ,α、[θ]λ,β、[θ]λ,γ 分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在波长λ处的椭圆率值，
fα、 fβ、 f γ
分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在蛋白质中所占重量百分比。
Typical Initial Concentrations:
1. 2. 3. 4. Protein Concentration: 0.5 mg/ml Cell Path Length: 0.5 mm Stabilizers (Metal ions, etc.): minimum Buffer Concentration : 5 mM or as low as possible while maintaining protein stability
图：三种LRR（lysine-rich repeat)家族肽的CD谱
2 CD谱非常适合研究蛋白质的构象变化
（1 ） 蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸结合的研究
图 A, Bob1（1-65）和Oct/DNA复合物的CD谱
图B，Oct/DNA/ Bob1（1-65）三元复合物的CD谱
（2 ） 克山病区粮饲养的豚鼠心肌线粒体膜的研究
单 色 器 棱 镜 样 品 室
LIGHT
调 制 解调器
光 电 探测器
前 置 放大器
（二）圆二色仪组成部分
1 光源 氙灯 2 起偏器 尼科耳棱镜: 天然方解石 Rochon棱镜：结晶状石英 3 调制解调器 （ＣＤＭ） 在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作 用是将单色的平面偏振光以这种频率交替 地变化为左、右旋圆偏振光。
（circular dichroism, CD)
（四）CD与ORD和吸收光谱的关系
1 旋光性和圆二色性
联系：都是由光学活性分子的不对称性引起的 二者之间相互联系，由其一可推知其二。 由Kroning-Kramers将二者联系起来。 差别： 一个孤立的生色团在所有波长均有旋光性。 圆二色性只在发生吸收的那些波长才能观测到。
模型动物心肌线粒体膜的CD谱
（a：病区粮喂养组；b：病区粮补加蔬菜喂养 组；c：正常对照组）
模型动物心肌线粒体细胞色素C的CD谱
（a：病区粮喂养组，15周前死亡；b：病区粮喂养组， 存活的；c：正常对照组）
（3）烟草花叶病毒侵染膜蛋白
（4 ）疏水表面对球状蛋白质二级结构变化的诱导作用
a:无规卷曲 b: 有β-折叠 c: 有α-螺旋 d: α-螺旋更多
2 光学活性物质(optical active substance)
(1) 定义 具有光学活性的物质，与手性物质等价。
（三） 旋光色散和圆二色谱
1 旋光性通常用旋光度α表示 ， α的大小 随入射波长 而变化的关系 称为旋光色散（optical rotatory dispersion, ORD) 。
2 圆二色性常用椭圆率（ellipticity) θ表示： tgθ = EL– Er = EL+ Er
b( 椭圆短轴） a ( 椭圆长轴）
3 文献上也常用光学活性物质对左、右圆偏振光的 摩尔吸收系数的差别Δε 来表示。
Δε = εL-εR = ΔA/CL = ΔA=AL- AR
AL-AR
CL
Δε或θ 随波长而变化的关系称为圆二色谱
振幅相等、 角频率相等、 相位相同 左右圆偏振光 合成线性偏振 光
参 照 面
α
φ1
φ2
振幅相等、 角频率相等、 相位不同 左右圆偏振光 合成线性偏振 光
参 照 面
a φ2
φ1
a
振幅不相等、 角频率相等 左右圆偏振光 合成椭圆偏振光
振幅相等、 位相差1/4波长 两束线偏振光 合成圆偏振光
（二） 光学活性和光学活性物质 1 光学活性
2 CD与ORD和吸收光谱的关系
CD谱中在λ= λ0处，[θ]λ取极值，（峰值或最小值）
ORD在λ= λ0处，[φ] λ=0
科顿效应： CD谱与吸收谱峰位基本接近，但吸收谱都是正值， 而CD谱则能显示正负。
ε 吸收谱 λ0 +
λ λ
Positive cotton effect
λ0 -
Negative cotton effect
含有不对称原子（结构) 的物质。具有光学活性。 一束平面偏振光进入手性分子时，手性物质会将其分解为 左右圆偏振光，并进行不同的处理。
（2）旋光现象
左右圆偏振光在手性分子中的行进（旋转）速度不同，通过 样品后，再次合成的偏振光相对于入射光旋转了一定角度。
（3）圆二色性
手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量 的振幅不同通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光， 而是椭圆偏振光。
4 光电倍增管 （PM） ５ 样品杯
由高度均匀的熔融石英制做，不会带来附加的原二色性， 也不会对光产生散射。 样品浓度要与样品杯光径配合，使待测样品的O.D.值 不大于２。
6 氮气保护装置
四 氨基酸和肽的圆二色性
（一）氨基酸的圆二色性
氨基酸分子中具有紫外生色团的有吲哚基，酚羟基，苯基，二硫键， 咪唑基，羧基。 酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，胱氨酸，脯氨酸在近紫外区（240-300nm) 对CD谱有贡献 羧基在200-210nm显示正峰。
（二）肽的的圆二色性
Secondary structure of macromolecule α-helix: 190 nm (+) 208nm, 222nm (-) β-sheet: 195nm (+) antiparallel: red shift parallel: blue shift 215-217nm (-) Unordered structure: (-) below 200nm (+) 218nm weak band [θ] x E-3
+ -
λ0
λ
3 CD与ORD和吸收光谱相比在结构分析中的优点
（1） 吸收谱均是正值，若同时存在多个吸收峰，其互相交叠， 分析困难。
（2） 对于ORD谱，任意波长处的旋光性是所有生色团贡献之和， 其极值与吸收谱不同。 （3） CD谱线可正可负，其极值与吸收谱一致。
三 旋光仪与圆二色仪
（一）圆二色仪光路图
二 基本原理
（一） 几种偏振光的概念
1 平面偏振光 （plane polarized light)
又称线偏振光(linearly polarized light) 对着光前进的方向观察时， 一束光 波的电场矢量（或磁场矢量）都是在同 一方向振动。
2 圆偏振光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋（在平面上的 投影为圆形）。 电矢量方向沿逆时针方向旋转，称为左圆偏振光 电矢量方向沿顺时针方向旋转，称为右圆偏振光
BSA 在疏水石英板表面的CD谱
（a.1ug/ml,60S; b. 5ug/ml,60S ;c .60ug/ml,60S ; d.60ug/ml,30min;e.60ug/ml,溶液中的BSA）
（5） 磷脂膜诱导的蜂毒素二级结构的变化
1α-螺旋84%，β-折叠1% 无规卷曲15% 2 α-螺旋27%，β-折叠20% 无规卷曲53%
One may find that the protein concentration needs to be adjusted to produce the best data. Changing this has a profound effect on the data, so small increments or decrements are called for. If that does not produce reasonably good data, a change in buffer composition may be necessary. It would also be a good idea to check the sample for unforeseen aggregation via Dynamic Light Scattering (DNA repair enzymes are an especially good example of this behavior). If buffer poses a problem, cells with shorter path (0.1 mm) and a correspondingly increased protein concentration and longer scan time can help.
α-helix β-sheet
0
unordered
200
210
220 230 240
nm β-turn: 180-190nm (-) 远紫外区（190-240nm) 200-205nm (+) 225nm (+) band, weak red shift
（三）含有金属离子的生色团
在波长大于300nm的区域，包括可见区域，对CD谱的贡献主要 来自像血红素一类含有金属离子的生色团，这一波段CD谱常用于研 究金属离子的氧化态、配位体以及链-链相互作用。
平面偏振光
左圆偏振光
右圆偏振光
3 椭圆偏振光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋（在平面上的
投影为椭圆形）。
4 自然光
对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量） 取所用可能方向，没有一个方向较其它方向占有优势。
（二） 几种偏振ຫໍສະໝຸດ Baidu的关系
圆二色技术及应用
一 序言 二 基本原理 三 圆二色仪 四 氨基酸和肽的圆二色性 五 圆二色技术的应用
一 序言
17世纪,Huggens,偏振光 1881年,Biot,石英能使偏振光的偏振面旋转, 1934年，Lowry, 《Optical Rotatory Power》 1953年，建立了第一台偏振光检测仪 19世纪60年代以后，圆二色仪出现
蜂毒素的CD谱
（1：蜂毒素插入单层膜的CD谱；2：蜂毒素吸附在单层膜上时的CD谱； 3：在Tris-HCL缓冲液中的蜂毒素CD谱）
t u co S
Conformational transition: from alpha-helix rich to beta-sheet rich PrPc PrPsc
五 圆二色技术的应用
1 利用圆二色谱，可以计算多肽二级结构的含量。
θ λ = f α [θ ]λ ,α + f β [θ ]λ , β + f γ [θ ]λ , γ
[θ]λ,α、[θ]λ,β、[θ]λ,γ 分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在波长λ处的椭圆率值，
fα、 fβ、 f γ
分别为α螺旋、β折叠和非周期结构在蛋白质中所占重量百分比。
Typical Initial Concentrations:
1. 2. 3. 4. Protein Concentration: 0.5 mg/ml Cell Path Length: 0.5 mm Stabilizers (Metal ions, etc.): minimum Buffer Concentration : 5 mM or as low as possible while maintaining protein stability
图：三种LRR（lysine-rich repeat)家族肽的CD谱
2 CD谱非常适合研究蛋白质的构象变化
（1 ） 蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸结合的研究
图 A, Bob1（1-65）和Oct/DNA复合物的CD谱
图B，Oct/DNA/ Bob1（1-65）三元复合物的CD谱
（2 ） 克山病区粮饲养的豚鼠心肌线粒体膜的研究
单 色 器 棱 镜 样 品 室
LIGHT
调 制 解调器
光 电 探测器
前 置 放大器
（二）圆二色仪组成部分
1 光源 氙灯 2 起偏器 尼科耳棱镜: 天然方解石 Rochon棱镜：结晶状石英 3 调制解调器 （ＣＤＭ） 在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作 用是将单色的平面偏振光以这种频率交替 地变化为左、右旋圆偏振光。
（circular dichroism, CD)
（四）CD与ORD和吸收光谱的关系
1 旋光性和圆二色性
联系：都是由光学活性分子的不对称性引起的 二者之间相互联系，由其一可推知其二。 由Kroning-Kramers将二者联系起来。 差别： 一个孤立的生色团在所有波长均有旋光性。 圆二色性只在发生吸收的那些波长才能观测到。
模型动物心肌线粒体膜的CD谱
（a：病区粮喂养组；b：病区粮补加蔬菜喂养 组；c：正常对照组）
模型动物心肌线粒体细胞色素C的CD谱
（a：病区粮喂养组，15周前死亡；b：病区粮喂养组， 存活的；c：正常对照组）
（3）烟草花叶病毒侵染膜蛋白
（4 ）疏水表面对球状蛋白质二级结构变化的诱导作用
a:无规卷曲 b: 有β-折叠 c: 有α-螺旋 d: α-螺旋更多
2 光学活性物质(optical active substance)
(1) 定义 具有光学活性的物质，与手性物质等价。
（三） 旋光色散和圆二色谱
1 旋光性通常用旋光度α表示 ， α的大小 随入射波长 而变化的关系 称为旋光色散（optical rotatory dispersion, ORD) 。
2 圆二色性常用椭圆率（ellipticity) θ表示： tgθ = EL– Er = EL+ Er
b( 椭圆短轴） a ( 椭圆长轴）
3 文献上也常用光学活性物质对左、右圆偏振光的 摩尔吸收系数的差别Δε 来表示。
Δε = εL-εR = ΔA/CL = ΔA=AL- AR
AL-AR
CL
Δε或θ 随波长而变化的关系称为圆二色谱
振幅相等、 角频率相等、 相位相同 左右圆偏振光 合成线性偏振 光
参 照 面
α
φ1
φ2
振幅相等、 角频率相等、 相位不同 左右圆偏振光 合成线性偏振 光
参 照 面
a φ2
φ1
a
振幅不相等、 角频率相等 左右圆偏振光 合成椭圆偏振光
振幅相等、 位相差1/4波长 两束线偏振光 合成圆偏振光
（二） 光学活性和光学活性物质 1 光学活性
2 CD与ORD和吸收光谱的关系
CD谱中在λ= λ0处，[θ]λ取极值，（峰值或最小值）
ORD在λ= λ0处，[φ] λ=0
科顿效应： CD谱与吸收谱峰位基本接近，但吸收谱都是正值， 而CD谱则能显示正负。
ε 吸收谱 λ0 +
λ λ
Positive cotton effect
λ0 -
Negative cotton effect