(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol

５Ｐ Ｒ ｒ ｒ ｅ ＇ ． Ｃ ｉ ｐｍ １１ ４
３Ｐ Ｒ ｍ ｒ ｉ ｅ ＇ ｐ Ｃ ｒ １１ ４ ５ Ｘ ｌ ａ Ｍｉ ｒ ｅ ｘ ０ ｏ ｍｅ ｓ Ｐｙ １１ ４ Ｈ Ｏ ２ ４４ ０１
１． 测序工作送 交上海博亚生物工程公司完成 ： ２ＤＡ Ｎ
１． ＭＴ ａ ｖｃｏ 购 自Ｐｏｅａ ３ｐ Ｅ － ｅ ｙ ｔｒ Ｇ ｓ ｅ ｒｍｇ 公司， 用于克隆 ＰＲ Ｃ 片段；
１． ＧＰＣ质粒为Ｃｏｔｃ公司产品，由 ４ ＥＦ－ｌ ｐ ｌｎｅｈ 本室扩增保存；
１ ｐＡ －－ ２ ５ ＧＴ １ Ｍ 质粒由 ． Ａ Ｇ 清华大学生物技术系孟安明 教授惠赠；
ＣＧＧＧ－ ｏ ３＇
反 转录条 （０ 体系） 件 ２川 ：
总 ＲＡ Ｎ １ｇ ４ Ｓ Ｒ Ｏｉｏｕｌ ｔ ｅ ＭＡ Ｔ ｇ ｎｃ ｏｉ ｌ ｅ ｄ １１ ４ 棍匀后 ，７ ０ ２ ２ Ｃ 分钟 。在 冰上冷 却 ２ 分钟。再依次加入 ：
色素抑制 剂苯脉 胺 ＮＰｅｙｔ ｉｕｅ （Ｔ） 肝素 、酵母 ｔＮ ，蛋白酶 Ｋ －ｈｎｌ ｏｒａ ＵБайду номын сангаас、 ｈ Ｐ ＲＡ ，马来酸 、
斑 马鱼平 滑肌 特异性基因 Ｓ ２。 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２
小羊血清、ＤＰ 、左 旋咪畔、多聚 甲醛 、甲酞胺购 自ｓ ｇａ 司： ＥＣ ｉｍ 公 、 ４ ．浪化乙锭 （Ｂ Ｅ ）为 Ｆ ｌａ Ｃ 公司产 品； ｕｋ Ａ Ｈ Ｇ ５ ．酚、氯仿 、异戊醇等 各类有机和 ＮＣ 等无机试剂均 为上 海试剂厂 产品； ａｌ
和Ｓ Ｉ ａＩ ｃ 酶切过夜， 酶切产物通过胶回 收试剂 盒回收， 调整终浓度为 ｌ ／ ， 转录 ｕ ｗ 作为 ｇｌ
原位杂交探 针的模板 。 ４ 体外转录 Ｇ Ｔ － 探针 ： ． ＡＡ １
反义 探针反应体系如下 （ 闪体系） ２ ０ ： 模板 （ＡＡ１ Ａ Ｓ ｌ Ｔ－ｃ Ｎ 一／ ｌ Ｇ Ｄ ａ 酶切产物） ５ 反应缓冲液 Ｘ
００ Ｍ ．２ ＤＴＴ
Ｐｗ ｒｃｉ Ｒ ｖｒ Ｔａｓｒ ｔ ｅ ｏ ｅ ｒ ｔ ｅｓ ｒ ｃｉａ Ｓ ｐ ｅ ｅ ｎ ｐ ｓ
ＨＯ ２
补足至 ２川 ０
４＇ １。置于冰上终止 反应 。 ２ Ｃ ｈ ｃＮ Ａ扩增 ：以上面获得 的 ｃＮ Ｄ ＤＡ为模板 ，反转 录引物 ＣＳ Ｄ 作为 ３端 ＰＲ ’ Ｃ 引物，取
Ｐ 程序为：首先 ９０预变性 ｌｉ，然后 ９０ １ ｓｃ ６０ ６ ｎ ２ 个 Ｃ Ｒ ５ Ｃ ｍｎ ５ ５ ， Ｃ ｍ ，共 ０ Ｃ ｅ ８ ｉ
循环。 ３ Ｐ Ｒ扩增 Ｇ Ｔ－ ｃ Ｎ 片段 ： ． Ｃ Ａ Ａ １ Ａ Ｄ
采用 Ｑａ ｎ ｏｇ 计用于 ｉ Ｌｎ 设 ｉｍ ｇ ｏ 检测 Ｇ Ｔ－ｃＮ ＡＡ１ Ａ的引物进行 Ｐ Ｒ克隆，引物 Ｄ Ｃ 序 列如下， 上游引 ５Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ 下游引 ５Ｇ Ｔ Ｔ 物： ＇ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ ３ － Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ ＇ ， 物： ＇ Ｃ Ｇ － Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ ＇ 采用前面获得的斑马鱼 ｃＮ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ｃ －， Ｃ Ｃ Ｃ Ａ３ Ｄ Ａ文库为模板。 扩增条件为： ９℃变性 ５ ４ 分钟后， ４ ９℃变性 ３ｓ ６℃退火 ３ｓ７℃延伸 ４ｓ 循环 ３ 轮（ｉ ｍｎ ０， ０ ０， ２ ５， ０ Ｑａ ｉ ｏ ｇ
斑马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆 、表达和功能研究 Ｍ２ ａ
Ｌｎ，９７０ ｏｇ １９） Ｐ Ｒ产物克隆到 Ｔ ｅａ ｖ ｃｏ Ｃ － ｓｙ ｔｒ上，通过连接 、转化 、小量抽提 、限制性 内切酶 ｅ 酶切、电泳 鉴定出正确克 隆，具体步骤参考 《 子克 隆实验 指南 （ 分 第三版 ） ，并通 过测序 验证 其正确性 。大量抽提 Ｇ Ｔ －ｃ Ｎ Ｔ质粒 ，分 别采 用 限制性 内切 酶 Ｓｌ ＡＡ １ Ａ－ Ｄ ａ ｌ
１． 粒转化受体菌 Ｍ ｏ ６质 ｔ 实验室提供 。 由本 实验材料
Ａ 系斑马鱼（ａｉｒ ｉ ，由 Ｂ品 Ｄ ｎ ｅｏ ｏ ） 清华大学生物技术系孟安明教授惠赠， ｒ 本实 验室繁殖
培 育。
方法
１ ．斑马 鱼胚胎组织 Ｒ Ａ抽提 （ Ｎ 具体步骤参考 ＱＡＥ 公司 Ｉ Ｎ 组织 ＲＡ Ｇ Ｎ 抽提试剂盒使用
说明） ：
收 －２ｈｆ 集发 育到６ ７ｐ 的斑马鱼胚胎约 ４０ ０ 枚，用 链蛋白 （ｍ／ｌ 酶 ２ｇｍ）去除 外膜， 置于 液氮中 研磨，加 ６０ｌ 液，再 ０ｐ ＲＴ Ｌ 加入ＲａｅＦｅ Ｄａｅ ７匀后， ５１ Ｎｓ ｒｅ ｓ， － Ｎ Ｍ ， 用 ｍ 注射 器抽打数次，离心。取上清加 ３０ ９％ 醇， ０川 ５乙 混匀后上柱，离心。 ５０ ＲＥ 加 ０川 Ｐ 液
因为 Ｓｃ 酶切后 的产物 有 ３突 出端 ， Ｉ ａＩ ＇ 如果直接转录会将载体序 列一并转录出来，
６ ．大量质粒抽提试剂 盒：Ｑａｅ Ｍｘ－ｒｐ ｔ ｉｇｎ ｉ ｅ Ｋ ； ａ Ｐ ｉ
７ ＲＡ ． 抽提试剂盒 为华舜公司产 品： Ｎ
８ ．反转录试剂盒购 自Ｃｏｔｃ 公司； ｌｎｅｈ
９ ＲＡ ． 纯化试剂盒购 自Ｑ ａｅ 公司 ； Ｎ ｉｇｎ
１． 产物及胶回收试剂盒： ｏｈ 公司 ０ＰＲ Ｃ Ｒｃｅ 产品； １． 引 １ Ｃ 物使用相关软件 ０ｉ ０自 ＰＲ １ ． 行设计，由 ｇ６ ｏ 赛百盛公司合成；
ＰＲ Ｃ 的方法进行扩增 ｃＮ。 １ Ｒ 作为模板反转录产生第一链 ｃＮ。 ＤＡ 取 Ｄ 总 Ｎ ｇ Ａ ＤＡ 反转录引
斑 马鱼平滑肌特异性基因 Ｓ ２ 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２ 。
物 ＣＳ 序 列 为 ５－Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ － （） －＇ ＭＲ Ｄ ＇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇｄ ３３ ， ＡＴ Ａ Ｔ ｏ Ｓ Ｏ ｉｏｕ ｌｏ ｉｅ ｌｇｎｃｅｔ ｄ 的序列 为 ５－ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ ＇ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ ＴＡ Ｇ Ｃ Ａ
１ ｎ Ｉ ４ 川
１０Ｍ Ｔ ０ｍ Ｄ Ｔ ２１ Ｐ
Ｒ ａｎ ｕｘ ０／ ） Ｎｓ （ ｌ ｉ ４ ｌ １ Ｐ ｌ Ｔ ＲＡ ７ 聚合酶 （ Ｕ ） Ｎ １ 小１ ５ １５Ｉ ． Ａ Ｒ ａ －ｅ ２ ＨＯ Ｎ ｓｆｅ ｅｒ 补足至２Ｐ ０１
Ｓ Ａ Ｔ ｇｎｃ ｏｄ 部分序列 ５ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ３ Ｍ Ｒ Ｏｉ ｕｌｔｅ ｌｏ ｅ ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ －’ － 作为５ ＇ 端
Ｐ Ｒ引物 ，进行 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ Ｃ Ｃ Ｄ Ａ． Ｐ Ｒ反应 体系： Ｃ Ｆｒ－ｔｎ ｃ Ａ ｄ Ｎ ｉｔ ｒ ｓ Ｓａ Ｄ １１ ４ １Ｘ Ｒ ｅ ｂｆ ｒ ０ Ｃ ｕ Ｐ ５１ ４ ５ Ｘ Ｔ Ｍｉ Ｐ ｘ ０ Ｎ ｄ １１ ４
聚合酶 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ０Ｍ Ｔ 含 ｘ ０ｍ Ｄ 溶液 ） ３ Ａ聚合 酶 （ ５ Ｔ 、Ｔ Ｒ Ｎ 含 ｘ反应缓冲 液和 ０ｍ Ｄ 溶液 ） ＲＡ酶抑制 剂 （ ａｉ） Ｒ ＲａｅＦ ｅ Ｄａｅ（ １０Ｍ Ｔ Ｔ 、 Ｎ Ｂ ｓｎ， Ｎｓ－ ｒｅ ｓ 含反应 Ｑ Ｎ
缓冲液及终止缓冲液） 等均购自Ｐｏｅａ ｒｍｇ 公司； 地高辛标记的核糖核昔酸混合物 （Ｉ ＲＡ ｅｉｇ ） ＤＧ Ｎ ｌ ｌｎ ｍｘ、封ｈ － ａ ｂ ｉ 〕 试剂 （ｌｃｉｇ ｂｏｋｎ ｒｇａｔ， ｎ） ｅｅ 祸连碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（ｎｉｄｇｘｇｎｎＡ Ｆｂ ｇｅｔ） Ａｔ－ｉ ｉｅｉ－Ｐ ｆａｍｎｓ， ｏ ａ ｒ 显色试剂 （Ｍ ｐｅ ｓｂｔａｅ 购 自Ｒｃ。 Ｂ ｐ ｌ Ａ ｕｓｒｔ） ｕ ｒ Ｐ ｏｈ 公司；
１． 注射仪， ２显微 包括持针器（Ｉ６１、 Ｈ－－）进针器（Ｎ１ ）支架（Ｊ１， 本Ｎｒｓｉ Ｍ－５ 、 １ Ｇ－） 日 ａｉ ｇ ｈｅ
公司产品；
１ 显微注射用针，由Ｄｕｍｎ 公司 １ 毛细玻璃管拉制而成； ３ ． ｒｍｏｄ ０ 川
１． ４拉针仪 （ＥＡ Ｐ ） ＨＫ Ｐ ５ ，日本 ＨＫ 公 司产 品； Ｉ ＥＡ １． ５荧光解剖镜 （Ｘ－２ ，日本 ＯＹＰＳ ＳＺ １） ＬＭＵ 公司产 品； １． ６数码相机 （９５ ， 本 ＮＫＮ Ｅ９ ） Ｆ Ｉ ＩＯ 公司产品 ； 主要试剂、试剂盒 、酶 、载体和菌株
１ ．各种限制性内 切酶、 ４ＤＡ Ｔ－Ｎ 连接酶、 ｌ ｏ 片段均为Ｎｗ ｇａｄ ｌｂ 公司 Ｋｅ ｗ ｎ ｅ Ｅ ｌｎ Ｂｏａｓ ｎ ｉ
产 品；
２ ＰＲ 应试剂， ． 反 Ｃ 包括： ａ 酶、 应缓冲液、 ＮＰ Ｔｑ 反 ｄＴ 等均购 自 上海申 能博 彩生物公司： ３ 位杂交试剂：Ｓ６ ．原 Ｐ ＲＡ聚合 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ ｍ Ｄ Ｎ 酶含 ｘ ０ Ｍ ０ Ｔ Ｔ溶液） Ｔ Ｒ 、 ７ Ｎ Ａ
ｌ Ｏ ｍＭ ａ ｈ ｅｃ ｄ ＮＴＰ
反 转录引 ＣＳ 物 Ｄ １ 州
１１ ｐ ２１ ４ １１ ４ ｌ１ ４
５ ｉ ｔ ｔ ｎ ｂ ｆ ｒ Ｘ ｒ － ｒ ｄ ｅ Ｆ ｓＳ ａ ｕ
到吸附 柱上， 离心。再用５０ ＲＥ ０川 Ｐ洗一次。 ０ Ｂａｅ ｅ ５川 ｓ ｆｅ水洗脱， ｒ 测定浓度，
电泳 鉴定Ｒ Ａ质量，－０ 贮存。 Ｎ ７℃ ２ ｃＮ 合成 ． Ａ 及扩增： Ｄ 采用 Ｃｏｔｃ ｎｅｈ公司的方法，在反转录产生第一条链 的时候，加入 ＳＡＴ ｌ ＭＲ
Ｏｉｏｕｌｏ ｉｅ ｌｇｎｃｅｔｄ ，可以有效的保证产生的 ｃＮ 的 ５端序列 比较 完整 ，并且可以通过 ＤＡ ＇
３ ＰＲ ． 扩增 仪 （２３ ） Ｃ ２３１ ，德 国 Ｅｐｎｏ ｆ ｐｅｄｒ 公司产 品； ４ ．电泳仪和 电泳 槽，上海辉煌科学 仪器 公司；
５ 凝胶成像系统，上海复日 ． 公司产品；
６ ．四孔双列恒温 水浴 锅 （Ｈ－９ ） ＨＳＢ９ ，浙江海 宁新 华医疗器械厂 ； 一 ７ ．电子天平 （Ａ０ ３，上海精科天平厂 ； Ｊ １０ ） ８ ．电热恒温培 养箱 （Ｈ Ｉ４０ ，上海跃进 医疗 器械厂； ＨＢＩ２ ） ９ ．超低温 冰箱 （ＡＹ ＭＦＵ０ ） 日 ＳＮＯ公司产品 ； ＳＮ Ｏ －５Ｖ ， 本 ＡＹ Ｄ １． ０控温 可调速 摇床 （Ｈ－ ） ＴＺＣ ，江 苏太仓 实验设备厂 ： １． １显微注射用 解剖镜 （Ｍ １３ＮＴ ） Ｍｔｃ公司产品； ＳＺ４－２Ｇ ， ｉ ｏ
斑 马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２ 。
材料和方法
主要仪 器和 设备 １ ．冷冻 台式离 心机 （８０ ， ０Ｒ ，德 国 Ｅｐ ｎｏｆ ５１Ｒ ５ ４ ） ８ ｐ ｅｄｒ 公司产 品；
２ 式离心 （ｅｔｉｕｅ １ ， ｉ ｉ） ．台 机 ｃｎｒｆｇ ５ ５ ｍｎｓ ｎ，德国Ｅｐｎｏｆ ４Ｄ ｉ ｐ ｐｅｄｒ 公司产品；