百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选_马璐琳

园艺学报 2012，39（6）：1141–1150 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选

马璐琳1,*，张艺萍1,*，丁鲲2，吴丽芳1，王祥宁1，崔光芬1，贾文杰1，段青1，王继华1,**

（1云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，昆明 650205；2云南省农村科技服务中心，昆明650021）

摘 要：对20个百合种质资源的组培苗进行尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）室内接种鉴定；以筛选出有较好抗性的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）为材料，以镰

刀菌诱导12和24 h的作为处理组，无菌水处理作为对照组，采用SMART技术构建了百合经镰刀菌诱导

后的抑制差减正、反向两个SSH文库。在正向文库中选择了4个抗病相关的ESTs，用半定量RT-PCR分

析这些ESTs的表达情况。经接种鉴定，20个百合种质资源中，对百合镰刀菌表现高抗的有3个，中抗9

个，感病8个；SSH文库ESTs片段大小为200 ~ 2 000 bp。依据斑点杂交结果，从正向SSH文库中挑取

50个单克隆进行测序和比对分析，得到6种共10条抗病相关EST。通过半定量RT-PCR对其中的4条抗

病相关ESTs：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，S/TPK）、谷胱甘肽S–转移酶

（glutathione S-transferase，GST）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和亲环素（cyclophilin，CYP）的表

达情况进行了分析，证明它们在一定程度上都受百合镰刀菌诱导而表现上调表达，推测其可能参与了百

合对镰刀菌枯萎病的抗病过程。

关键词：百合大花卷丹；百合尖孢镰刀菌；SSH文库；基因表达分析

中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）06-1141-10 Resistance Identification of Lily Germplasms to Fusarium oxysporium and Screening of the Resistance Related Genes

MA Lu-lin1,*，ZHANG Yi-ping1,*，DING Kun2，WU Li-fang1，WANG Xiang-ning1，CUI Guang-fen1，JIA Wen-jie1，DUAN Qing1，and WANG Ji-hua1,**

（1Yunnan Flower Breeding Key Lab，Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China；2Yunnan Rural Science and Techology Service Center，Kunming 650021，China）

Abstract：Tissue culture seedlings of 20 lily germplasms were identified for resistance against Fusarium oxysporium by an in vitro inoculation method in laboratory，the highly resistant lily（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）was used to construct the forward suppression subtractive hybridization（SSH）library and the backward SSH library using the SMART method. The seedlings were induced by F. oxysporum f. sp. lilii for 12 h and 24 h after inoculation and those treated by water were taken as control. Four resistance-related ESTs were analyzed by the semi-quantitative RT-PCR. The results

收稿日期：2012–01–10；修回日期：2012–04–28

基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100208）；农业部花卉行业科技专项（200903020）；云南省社会发展科技计划项目（2009ZC140M）* 共同第一作者

** 通信作者Author for correspondence（E-mail：wangjh0505@）

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showed that 3 of 20 identified lily germplasms were highly resistant，nine of them were middle resistant and 8 were susceptible；The inserted segments of SSH library were 200–2 000 bp in length；According to the results of dot blot hybridization，fifty clones of the forward library were picked out and sequenced，and then 6 classes 10 resistance-related ESTs were obtained. The RT-PCR results of 4 resistance-related genes （serine/threonine protein kinase，glutathione S-transferase，peroxidase，cyclophilin etc.）showed that they were upregulated by F. oxysporum f. sp. lilii and supposed to involved in the disease resistance reaction for Fusarium wilt.

Key words：Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker；Fusarium oxysporum f. sp. lilii；suppression subtractive hybridization（SSH）library；gene expression analysis

镰刀菌枯萎病又称根腐病、茎腐病，是百合生产中危害最严重的病害。利用抗镰刀菌枯萎病种质资源，筛选发掘抗病基因，培育抗病品种是防治百合镰刀菌枯萎病最经济有效的方法。Straathof 和van Tuyl（1994）研究发现东方百合对镰刀菌抗性最差，麝香百合次之，亚洲百合最强。刘妍等（2009）通过田间镰刀菌接种试验，对部分东方百合进行了抗镰刀菌鉴定工作，筛选出一个对镰刀菌麟茎腐烂病有较强抗性的材料。杨秀梅等（2010）对包括兰州百合、卷丹、麝香百合和多斑豹子花等4个中国野生百合在内的40份百合资源进行抗镰刀菌鉴定，发现兰州百合表现为高抗，卷丹表现为中抗。在百合抗性基因的发掘方面，Straathof等（1996）运用RAPD分子标记对亚洲百合杂种系的镰刀菌抗性进行了遗传分析，筛选出3个与镰刀菌抗性显著相关的标记。Shahin等（2009）运用3种不同的分子标记系统（DArT、AFLP和NBS profiling）构建了亚洲百合回交群体的遗传图谱，并将4个抗镰刀菌QTL位点进行了定位。

本研究中对部分中国野生百合资源和栽培品种进行镰刀菌抗性评价与鉴定，筛选优良抗性资源，在此基础上利用对百合镰刀菌具有较好抗性的中国野生百合大花卷丹为试材，采用室内人工接种百合尖孢镰刀菌诱导抗病相关基因表达，通过SMART技术构建镰刀菌诱导的抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）文库，获得与镰刀菌枯萎病抗性相关的ESTs，通过生物信息学分析文库中ESTs序列的种类与特性，并对部分抗病相关ESTs的表达谱进行分析。本研究中采用百合组培生根苗进行室内镰刀菌枯萎病抗性鉴定，可以克服有些野生百合资源因种球稀少而难以满足试验要求的缺点，同时又能缩短试验周期，加快百合种质抗性筛选进程；通过构建并筛选SSH文库，可以降低目标基因克隆的假阳性，有效获得百合镰刀菌抗性相关ESTs，为百合镰刀菌枯萎病抗性基因的筛选发掘及抗病育种提供一定研究依据。

1 材料与方法

1.1 百合种质资源对镰刀菌抗性鉴定

百合资源组培苗扩繁及接种鉴定试验于2010年3—9月，在云南省农业科学院花卉研究所组培室进行；SSH文库构建及候选基因表达分析试验于2010年10月—2011年8月，在云南省农业科学院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室进行。

将云南省农业科学院花卉研究所百合课题组离体保存的20份百合资源（8份东方百合品种，5份亚洲百合品种，7份中国野生百合，表2）扩繁后，接种至生根培养基（MS + NAA 0.1 mg · L-1）中（张艺萍等，2006），采用生根苗进行接种鉴定。

百合组培苗培养所需要MS基本培养基的试剂和植物生长调节剂如NAA等均购自昆明赛贝斯