无菌检查法及其验证
无菌检查(薄膜过滤法)SOP
无菌检查SOP（薄膜过滤法）1.目的为规范无菌检查方法及无菌检查全过程的操作，最大限度防止试验操作过程造成的污染，确保结果准确。
2.范围本SOP适用于生物制品的中间产品（包括原液、纯化产物、半成品、生产中的液体、辅料等）、成品的无菌检查。
只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
3.定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6.材料6.1.无菌检查用物品、物料要求：所有物品、物料进入无菌室前，均应经过高压蒸汽灭菌（121℃40分钟，放灭菌指示卡）或180℃干烤2小时或其它经过验证的方法消毒后传入无菌室；如不能用前者消毒方式消毒的物品，须经消毒液浸泡、擦拭后传入无菌室。
6.2.无菌检查环境要求：应在环境洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
6.3.仪器、设备与设施集菌仪、显微镜、台式灭菌器、无菌试验室（万级）、超净工作台（万级背景下的局部百级）：每月环境检测（沉降菌、浮游菌、尘埃粒子）合格后，方可使用。
20-25℃培养房或培养箱、30-35℃培养房或培养箱。
6.4.试验用具：洁净工作服（洁净底服、十万级工作服、万级工作服、鞋套）、工作鞋、口罩及帽子；无菌医用手套或一次性乳胶医用手套：试验前及试验过程中用消毒液浸泡消毒；封闭式集菌培养器（双针头、三联及单针头、三联）：薄膜孔径不大于0.45μm，直径约为 50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。
中国药典2020无菌检查法
中国药典2020无菌检查法无菌检查法是药品生产过程中非常重要的一项质量控制检测方法，它主要用于检测药品是否受微生物污染，确保药品的无菌状况符合规定的标准。
中国药典2020年版中对无菌检查法进行了详细的规定和说明，本文将对中国药典2020版中关于无菌检查法的要点进行介绍。
一、无菌检查法的概述无菌检查法是指通过将药品接种于特定培养基上，经过一定时间的培养和观察，判断药品中是否存在微生物污染。
它是一种定性的检测方法，可较为准确地判断药品为无菌状态还是受菌状态。
二、无菌检查法的适用范围无菌检查法适用于各类药品的无菌检测，包括注射剂、眼用制剂、气雾剂、洗眼液等。
不同药品的无菌检查方法可能存在一定差异，药企在进行检测时应参照中国药典2020版中的规定进行操作。
三、无菌检查法的操作步骤1. 准备好所需器材和培养基：包括培养皿、无菌针、无菌培养基等。
根据具体的检测要求选择相应的培养基。
2. 无菌操作：操作人员需穿戴无菌手套、无菌帽等无菌防护用品，采用无菌环境进行操作，以尽量降低外界污染。
3. 取样并接种：根据药品的不同形式，采取适当的方法进行取样，并将样品接种于培养基上。
4. 培养和观察：将接种好的培养基置于适宜的温度和条件下进行培养，在规定时间内观察培养皿中是否有微生物生长。
四、无菌检查法的结果解读无菌检查法的结果由操作人员根据培养皿中的生长情况进行判读，一般可分为以下几种情况：1. 无菌：培养皿中无任何菌落生长。
2. 受菌：培养皿中存在微生物的生长，可能意味着药品受到了微生物污染。
3. 有疑似菌落：培养皿中存在一些不明确的菌落，需要进行进一步的鉴定和确认。
五、无菌检查法的注意事项1. 操作人员应严格遵循无菌操作规范，避免外界污染。
2. 选择合适的培养基和培养条件，以确保对不同种类微生物的检测灵敏性和准确性。
3. 对存在疑似菌落的样品进行进一步的鉴定，以确定是否存在真正的微生物污染。
4. 注意培养基的保存和贮存条件，保证培养基的质量和可靠性。
1101无菌检查法
域内进行。 A 级和 B 级区域的空气供给应通过终端高效空 气过滤器(HEPA）。
二、无菌检查法方法解析 —培养体系
One
培养基的种类及适用范围
Two
培养基灵敏度检查
Three
稀释液、冲洗液及其制备方法
二、无菌检查法方法解析 —培养体系
1、培养基种类及适用范围
液和半成品最少检验数量 2.表2上市抽验样品的最少检验数 量 3.表3 供试品的最少检验量
二、无菌检查法方法解析 —供试品的无菌检查
4、薄膜过滤法的整合修订
2010版 2015版
供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 2. 水溶液供试品增加：除生物制品外，一般样
品冲洗后，1 份滤器加入100ml 硫乙醇酸 盐流体培养基，1 份滤器加入100ml 胰酪 大豆胨液体培养基。生物制品样品冲洗后 ，2 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培 养基，1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液 体培养基。
的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有 应将所有容器内的全部内容物过滤。 容器内的全部内容物过滤。
二、无菌检查法方法解析 —供试品的无菌检查
3、表1、表2、表3的整合
2010版
1.表1 批出厂产品最少检验数量
2015版
1.表1 批出厂产品及生物制品的原
2.表2 液体制剂最少检验量及上市抽 验样品的最少检验数量 3.表3 固体制剂最少检验量及上市抽 验样品的最少检验数量
1101无菌检查法
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
无菌检查法的概况
无菌检查法方法解析
中国药典收载情况
实验环境
中外药典系统性差异
2015年版药典 无菌检查法
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。
USP无菌检验-隔离器系统验证指南
无菌检验——隔离器系统验证USP <1208>Sterility Testing—V alidation of Isolator System/General informance这部分是用于无菌检验隔离器系统的简明验证指南（注意：在这个章节中，“已灭菌”指的是物品或者表面的微生物被清除的状态）在19世纪80年代中期，建立一个无菌检验环境的隔离器就已经开始使用。
隔离器可以通过密封的方法或者采用过滤除菌空气保持正压的方法，创造一个无菌的环境。
当隔离器处于密闭状态时，仅仅能够在隔离器内部和快速传递仓传递物品；当隔离器打开时，允许通过一个特殊设计的并经过验证可以避免污染物进入的开口递出物品。
隔离器采用柔软的塑料（例如聚氯乙烯）、硬塑料、玻璃或不锈钢制造。
由于隔离器系统从根本上避免了分析人员与物品的直接接触，因此在无菌检验操作时可以避免物品和辅助设备被污染。
当隔离器内部与环境完全隔离时，隔离器内部的物品是无菌条件下的传递。
操作者穿着半身衣在隔离器内部进行无菌操作，半身衣是连接在隔离器墙体上的柔软的部分，操作者穿着半身衣有足够的范围在隔离器内部进行操作，操作者也可以通过连接在隔离器墙体上的袖子和手套进行操作。
在隔离器中，不要求操作者穿着特殊的无菌衣进行操作，允许操作者穿着标准的实验室服装进行操作。
为确保隔离器内部无菌。
使用杀孢子剂对隔离器内部进行灭菌处理。
隔离器设计和建造空气处理系统用于无菌检验的隔离器需要配备除菌过滤器（HEPA过滤器是被要求的）。
静态时，要求隔离器尘埃粒子符合美国联邦标准209E的100级空气质量要求（看洁净室微生物评价和其他环境控制《1116》）。
动态时，不要求隔离器符合100级空气质量要求，不要求隔离器内部的空气流速或者空气交换频率。
隔离器系统是要求防止泄漏的，然而，它不是通常意义上的防止隔离器与外界环境进行的空气交换。
当与外界环境直接相连的门打开时，隔离器内部的正压保证隔离器内部的无菌环境不被污染。
无菌、微生物限度检查及方法验证
01
02
03
直接接种法
将样品接种在培养基上， 观察是否有微生物生长。
薄膜过滤法
将样品通过薄膜过滤，收 集滤膜上的微生物，再进 行培养。
离心沉淀法
将样品离心，收集沉淀物 中的微生物，再进行培养 。
无菌检查的注意事项
确保环境洁净
无菌检查需要在洁净的环境中进行，以避免 外界微生物的污染。
避免样品中防腐剂的影响
方法验证
方法验证的定义与目的
定义
方法验证是对检测方法的可靠性、准确性和可重复性的评估过程，以确保该方 法能够满足预期的检测要求。
目的
方法验证的目的是确保所采用的无菌、微生物限度检查方法具有足够的灵敏度 、特异性、重现性和可操作性，以保证检测结果的准确性和可靠性。
方法验证的流程
准备验证计划
制定详细的验证计划，包括验 证实验的设计、实验步骤、数 据收集和分析等内容。
进出口检验
进出口药品需要进行严格的微生物限度检查，以确保药品符合进口 国或地区的质量标准，保障公众健康。
方法验证在药品质量控制中的应用
验证无菌、微生物限度检查方法的可靠性
通过方法验证可以确保无菌、微生物限度检查方法的准确性和可靠性，提高药品质量控制 水平。
评估检测方法的性能指标
方法验证过程中需要对检测方法的性能指标进行评估，如灵敏度、特异性、重现性等，以 确保检测结果的准确性和可靠性。
如果样品中含有防腐剂，可能会抑制微生物 的生长，因此需要进行相应的处理。
正确选择培养基
根据待测样品的特性，选择适合的培养基， 以确保微生物能够正常生长。
定期进行方法验证
无菌检查方法需要定期进行验证，以确保其 可靠性。
0义与目的
无菌检查法及其验证
无菌检查法及其验证
第8页
培养基储存
• 制备好培养基应该保留在2-25℃、避光环 境，若保留于非密闭容器中，普通在3周内 使用；若保留于密闭容器中，普通可在1年 内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 使用期。
无菌检查法及其验证
第9页
培养基适用性检验
本检验可在供试品无菌检验前或与供试品 无菌检验同时进行。 • 无菌性检验
无菌检查法及其验证
第24页
阳性对照试验
• 目标：①验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌作用， 确保检验条件符合要求，预防出现假阴性。②培 养条件是否符合要求。
• 应依据供试品特征选择阳性对照菌。 ①无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 ②抗革兰阴性-大肠埃希菌
③抗厌氧菌-生孢梭菌 ④抗真菌-白色念珠菌
无菌检查法及其验证
第28页
• 对无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不 符合无菌检验法要求；
• 回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原 因；
• 供试品管中生长微生物经判定后，确证有微生物生 长是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技 术不妥引发。
无菌检查法及其验证
第29页
试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长， 判供试品符合要求，若有菌生长判供试品 不符合要求。
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基都有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
第14页
培养基适用性检验
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌培养 基管均生长良好，判该培养基灵敏 度检验符合要求。
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
药品无菌检查(薄膜过滤法)能力验证结果与分析
备供试品溶液，进样测定，测得样品中芍药苷的平均含量为１ ９８ｍｇ·ｇ－１，计算其ＲＳＤ为０ ５６％。
２ ５ 加样回收率２ ５ １ 对照品溶液配制：取芍药苷对照品１５ ２６ｍｇ，精密称定，置２５ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为芍药苷加样母液（Ａ）。
２ ５ ２ 样品溶液的制备：取９个１００ｍＬ具塞锥形瓶，标记瓶号１～９，分别准确移取１ ０ｍＬ（Ａ）加入到１～３号瓶，准确移取２ ０ｍＬ（Ａ）加入到４～６号瓶，准确移取３ｍＬ（Ａ）加入到７～９号瓶，将１～９号瓶吹干，分别取约０ ６ｇ的样品加入１～９号瓶，按１ ２ ３精密称定之后操作。
表２ 加样回收试验结果 （ｎ＝９）项目芍药苷回收量（ｍｇ）芍药苷实际加入量（ｍｇ）回收率（％）平均回收率（％）ＲＳＤ（％）加样回收０ ５倍 １０ ５７５０ ５８０９９ ０８加样回收０ ５倍 ２０ ５８４０ ５８０１００ ５４加样回收０ ５倍 ３０ ５７５０ ５８０９８ ９８加样回收１倍 １１ １５４１ １６１９９ ３８加样回收１倍 ２１ １６２１ １６１１００ ０６９９ ３８０ ７１加样回收１倍 ３１ １４９１ １６１９８ ９４加样回收１ ５倍 １１ ７４１１ ７４１９９ ９６加样回收１ ５倍 ２１ ７２９１ ７４１９９ ２８加样回收１ ５倍 ３１ ７１０１ ７４１９８ １９２ ６ 稳定性试验 在“１ ２ １”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液５μＬ，注入液相色谱仪，分别于０、２、４、６、８、１２、１６ｈ测定，求得芍药苷峰面积的ＲＳＤ值为０ ２４％。
结果表明，供试品溶液在１６ｈ内稳定。
２ ８ 耐用性实验 考察不同色谱柱、柱温、流速对测定方法的影响，芍药苷平均含量为２ ００ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ为０ ８２％。
２ ９ 十批次疏风愈痛丸含量测定结果 测定十个批次疏风愈痛丸中芍药苷含量，测得平均含量为２ ００ｍｇ·ｇ－１，下浮２０％，将芍药苷的限度定为每１ｇ不少于１ ６０ｍｇ，列入含量测定项正文。
无菌检查法(逐字对比20版药典变化)
无菌检查法，逐字对比20版药典变化无菌检查的定义及无菌检查的适用条件无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。
胰酪胨 1.50g氯化钠 2.5g酵母浸出粉 5.0g葡萄糖/无水葡萄糖 5.5g/5.0g新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0mlL-胱氨酸0.5g琼脂 0.75g硫乙醇酸钠 0.5g水 1000ml(或硫乙醇酸）（0.3ml）除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH, 使灭菌后在25℃的PH值为7.1土0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
2、胰酪大豆胨液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化3、中和或灭活用培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加人适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。
4、0.5 %葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化5、胰酪大豆胨琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化6、沙氏葡萄糖液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化7、沙氏葡萄糖琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化培养基的适用性检查无菌性检查每批培养基一般随机取不少5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
1101无菌检查法
1101无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
无菌检查方法学验证
2006年8月
无菌检查方法学验证
方法学验证资料试验结论
采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处
理等因素
2006年8月
无菌检查方法学验证
三、验证及资料中常见的问题
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]
2006年8月
无菌检查方法学验证
菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病 性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。
国药典发[2005]98号
各药品检验所： 根据国食监注[2005]234号“关于颁布和执
行《中国药典》2005年版有关事宜的通知” 规定，《中国药典》7月1日起开始执行，各 药品检验所在执行“微生物限度检查法”和 “无菌检查法”过程中遇到了一些问题，为 保证《中国药典》2005年版的顺利实施，现 就有关问题说明如下：
2006年8月
无菌检查方法学验证
直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫 乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于 100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取 符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的 白色念珠茵、黑曲霉各2管。其中1管接 人规定量的供试品，另1管作为对照，按 规定的温度培养3～5天。
2006年8月
无菌检查法
无菌检查法（2010版）
• 供试品接种及培养基接种 • 薄膜过滤法 采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为 50mm，根据供试品及其容剂的特性选择滤膜材质。使用时应保证滤 膜在过滤前后的完整性。 • 水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜，油类供试品， 其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率， 应注意保持供试品溶液和冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品溶液经 薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗，每张滤膜每次冲洗量一般为 100mL，总冲洗量不得超过1000mL，以避免滤膜上的微生物受损伤。 • 水溶液供试品：取规定量，每支（瓶）供试品装量为5mL及以下者， 全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。 • 水溶液固体供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明 复溶，然后按水溶液供试品项下的方法操作。
2
2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 无菌检查环境 2015版 环境洁净度B级背 景下的局部A级洁 净度 硫乙醇酸盐流体 培养基（FT）和 胰酪大豆胨液体 培养基（TSB） 每批取不少于5支 （瓶） 2010版 环境洁净度10000 下的局部洁净度 100级 硫乙醇酸盐流体 培养基和改良马 丁培养基 每批取10支（瓶）
2
2015版与2010版药典无菌检查法对比
改变项目 方法适用性检查 2015版 2010版
菌种：金葡、枯草、生 菌种：金葡、枯草、铜 孢、大肠埃希菌、白念、 绿、白念、黑曲霉 黑曲霉
2015版药典三部保留了生物制品无菌检查法的特点，如检验数量、 硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。 由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验也进行了修 订。
M≥5g
半量
中国药典 无菌检查法
中国药典无菌检查法在当今的医药行业中，无菌检查法是确保药品安全性和有效性的重要手段。
中国药典作为我国药品质量标准的权威法规，对于无菌检查法的规定和实践具有极其重要的指导意义。
本文将详细阐述中国药典中无菌检查法的相关内容，以期为药品生产和质量控制提供有益的参考。
一、中国药典无菌检查法概述中国药典无菌检查法是针对药品中微生物污染进行检查和评估的标准方法。
该方法通过对样品进行适当的处理、培养和观察，以确定样品中是否存在微生物。
无菌检查法对于保证药品质量和安全性具有至关重要的作用，因为微生物污染可能导致药品失效、不良反应甚至危害患者健康。
二、无菌检查法的实践操作1.样品采集与处理在进行无菌检查之前，必须对样品进行适当的采集和处理。
采集的样品应当具有代表性，能够反映药品的整体质量。
处理过程中应避免交叉污染和外界微生物的引入。
2.培养基的选择与制备无菌检查中使用的培养基必须符合中国药典的规定，具有良好的选择性、灵敏度和特异性。
培养基的制备过程需严格按照配方进行，确保质量和稳定性。
3.接种与培养将处理后的样品接种于适宜的培养基中，按照规定的温度和时间进行培养。
接种过程中要保证无菌操作，防止污染。
4.观察与结果判定在规定的培养期结束后，对培养基进行仔细观察，记录任何可见的微生物生长情况。
根据观察结果进行无菌检查的判定，确定药品是否符合无菌要求。
三、无菌检查法的质量控制为确保无菌检查法的准确性和可靠性，必须加强实验室的质量控制。
这包括对实验人员的培训、实验设备的维护与校准、实验环境的监控以及实验过程的规范化和标准化。
同时，应定期进行内部审核和外部质量评估，以确保无菌检查法的执行符合中国药典的要求。
四、结论与展望无菌检查法作为药品质量保证的重要环节，在医药行业中具有举足轻重的地位。
中国药典作为我国药品质量的法规性文件，对于无菌检查法的规定和实践提供了明确的指导。
通过深入理解和严格执行中国药典的相关要求，我们能够更好地保障药品的安全性和有效性，为公众健康事业做出积极贡献。
无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XIIA
附录XII A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。
1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
药典无菌检测法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。
培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
∙1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌）酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠 2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml；L -胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g（或硫乙醇酸0.3ml）；水1000ml；酵母浸出粉5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
∙2、改良马丁培养基（用于培养真菌）胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为 6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为 6.4±0.2，分装，灭菌。
无菌检查法包括
无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。
前者适用于非抗菌作用的供试品，后 者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。
操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌 的方法取内容物。
凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。
1. 直接接种法 (1) 供试品准备供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶 液，按表1或表2规定量取供试品，混合。
供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料， 按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9％无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的 溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。
供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪 取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11 股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以 浸没供试品的适量培养基中。
或用0.9％无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、 输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。
供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭 活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。
亦可按薄膜过滤法检查。
供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。
每 管接种量为0.2ml。
2.操作取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌 培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培 养基5管。
轻轻摇动,使供试品与培养基混合。
需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真 菌培养基管置20～25℃培养7日。
在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。
阳性对照 管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外 观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上 继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用 接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。
药品无菌检查
、生孢梭菌（4种 梭菌（3种菌）
菌）
改良马丁：白念、 胰酪大豆胨液体：
黑曲
枯草、白念、黑曲
（2种菌）
（3种菌）
2015年版药典的变化
• 菌种的培养条件改变
药典 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
2010年版
2015年版
营养肉汤/营养琼脂
试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌 作用可以忽略不计； 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢 或不生长----供试品的该检验量在该检验条件下有抑 菌作用-----增加冲洗量、培养基用量、中和剂或灭 活剂、更换滤膜品种，重新进行方法适用性试验。
药品无菌检查法
• 供试品的无菌检查
检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量 出厂产品按表1，上市产品监督检验按表2 最少检验数量不包括阳性对照用的。
药典 培养系统1 培养系统2
2010年版
2015年版
硫乙醇酸盐流体： 硫乙醇酸盐流体：
金葡、铜绿、枯草 金葡、铜绿、生孢
、生孢梭菌 梭菌
改良马丁：白念、 胰酪大豆胨液体：
黑曲
枯草、白念、黑曲
2015年版药典的变化
• 方法适用性实验：
药典 培养系统1 培养系统2
2010年版
2015年版
硫乙醇酸盐流体： 硫乙醇酸盐流体：
• 灭菌医用器具供试品 必要时将其拆散或切成小碎段，等量接 种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
• 放射性药品 取供试品1支，等量接种于装量为7.5ml的流乙醇酸 盐流体培养基和TSB中。每管接种量为0.2ml。
药品无菌检查法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
结果判断
前提:阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，无菌 检验方有效。 • 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌 生长，判供试品符合规定。 • 若供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长， 判供试品不符合规定。 • 除非能充分证明，生长的微生物非供试品所含。 • 当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果 无效：
供试品溶液的制备
④非水溶性制剂供试品 取规定量，直接过滤或混合溶于含聚山梨酯80或 其它适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过 滤。用含0.1%-1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至 少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培 养。培养基接种照水溶液供试品项下的方法操作。 其他类供试品： ⑤可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试 品 ⑥无菌气（喷）雾剂供试品 ⑦装有药物的注射器供试品 ⑧具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品
阴性对照
• 不加样品的无菌检验 • 目的：确认无菌检验所用的稀释液、冲洗液、培 养基、青霉素酶、集菌器等物品及人员操作、检 验环境、仪器设备等是否有菌存在。 • 应取相应溶剂和稀释剂同法操作。 • 应与无菌检验同时做。 • 阴性对照不得有菌生长。
培养及观察
• 供试品无菌检查培养温度和时间非常重要，只 有在合适的温度和时间内微生物才能生长良好。 • 培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种 至同种培养基或划线接种于斜面培养基上，培 养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长，或镜 检进行判断。
无菌检验的局限性
• 从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应 对每个容器进行无菌检查。但是无菌试验对样 品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的 产品进行检查。 • 统计概率的局限性 ：对于低污染水平的产品， 其局限性在统计学上更为明显。 • 检验条件的局限： 样品中污染的微生物的检 出受多种因数的影响，只有在各检验条件符合 污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样 品的无菌检验结果的准确性。 • 污染的检出率要比实际产品的污染率低
无菌检查的设施、环境、人员
• 检查环境应在洁净度10000级下的局部洁 净度100级的单项流空气区域内或隔离系 统中进行，其全过程必须严格遵守无菌 操作。 • 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌检查的设施、环境、人员
• 规定应定期按《医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净度的验证。 • 日常检验还需对试验环境进行监控。
供试品的无菌检查法--薄膜过滤法
• 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长）， 然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。 • 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶 性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。 使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 • 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每 张滤膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过1000ml， 以避免滤膜上的微生物受损伤。 • 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般 薄膜过滤器。滤膜孔径不大于0.45μm，直径约为50mm。
供试品溶液的制备
②可溶于水的固体制剂供试品 取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复 溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。 ③β-内酰胺类抗生素供试品 取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理法 处理，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含 适量β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜 上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加 少量的β-内酰胺酶；或将滤膜直接接入含适量 β-内酰胺酶的培养基中。接种培养基的方法照水 溶液供试品项下的方法操作。
供试品的无菌检查法
• 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数 量 • 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对 照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每个培 养基容器接种的样品量作为阳性对照。 • 检验量 指一次试验所用供试品总量（g或ml），若 每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基， 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养 基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法 的供试品总量，只要供试品的特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤.
• 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求； • 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染 的因素； • 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证有微生 物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无 菌操作技术不当引起的。
试验若经确认无效，应重试。重试时，重 新取同量供试品，依法重试，若无菌生长， 判供试品符合规定，若有菌生长判供试品 不符合规定。
培养基的适用性检查
• 灵敏度检查 ①菌种 • 硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
• 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉
培养基的适用性检查
②菌种选择的原则 • 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株 (或该药品中常见的污染菌)。 • 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。 • 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。 • 加菌量:＜100cfu。
无菌检查法概念
• 指用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌 的一种方法。 • 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现被微 生物污染。
无菌检查法概念
• 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。 • 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。 • 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。
无菌检查的稀释液、冲洗液
• 无菌检验所用稀释液、冲洗液种类应对微生物无毒、 无抑制作用。稀释液用量、冲洗液冲洗次数及用量等 应当与验证合格的方法一致。每张滤膜每次冲洗量为 100ml，总冲洗量不宜过大（不超过1000ml），用量过 多不仅容易破坏滤膜上截留的微生物，而且对滤膜造 成损伤；但也不能太少，否则不能将供试品冲洗干净， 无法消除抑菌性。 • 0.1%蛋白胨水溶液 • PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 如需要可加入表面活性剂或中和剂,应经方法验证证明 其有效性，并对细菌存活无影响。
培养基的适用性检查
③
菌液制备
试验菌 培养基 培养温度 30-35 培养时间 18-24
金黄色葡萄球菌 营养肉汤 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体 白色念珠球菌 改良马丁培养基 黑曲霉 改良马丁琼脂斜面
23-28
24-48 5-7天
培养基的适用性检查
④培养基接种 试验菌 培养基
无菌检查的设施、环境、人员
• 无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 并经过无菌技术的培训。
无菌隔离系统
• 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。 • 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
每管装量 接种管数 接种量 培养时间
2支 1 ml 3天
硫乙醇酸盐 12 ml
白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 黑曲霉
2支
1 ml
5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
培养基的适用性检查
供试品的无菌检查法
• 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。 • 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。 • 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性，提高检出率。
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。 • 试验同时应做空白对照
培养基说明
• 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。 • 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。 • 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。
供试品溶液的制备
•
•
• •
①水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的 无菌容器内，混匀，立即过滤。 如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用适量的 冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。 冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫 乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应 的滤筒内。 如果采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3 等份，分别臵于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及 改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。
•
•
• •
阳性对照试验 目的：①验证供试品经灭活后或用其它方式（稀 释、冲洗等）处理后是否仍有抑菌或杀菌的作用， 确保检验条件符合要求，防止出现假阴性。②培 养条件是否符合要求。 应根据供试品的特性选择阳性对照菌。 ①无抑菌及抗革兰阳性-金黄色葡萄球菌 ②抗革兰阴性-大肠埃希菌 ③抗厌氧菌-生孢梭菌 ④抗真菌-白色念珠菌 阳性对照菌加量：＜100cfu 阳性对照培养48-72h 应生长良好。