微生物细胞工程

线照射灭活后与另一方活的原生质体融合，可提高其融合
频率5~10倍。 • 推测紫外线灭活原生质体一方或双方，诱导遗传物质的单 向传递或是致死损伤互补，而紫外线照射是否能引起附加 突变而影响遗传分析，这些问题至今未见报道。
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（2） 原生质体的分离、再生和回复
• ④原生质体与脂质体融合： • 青霉素产生菌突变阻断三肽前体的生物合成，这种不产生 青霉素突变型原生质体，与包裹着α-三肽的脂质体相混合，
三 真菌的原生质体融合
• （一）酵母的原生质体融合 • （二） 霉菌的原生质体融合
（一）
酵 母 的 原 生 质 体 融 合
融 合 技 术 要 点
（一） 酵母的原生质体融合
（一）
酵 母 的 原 生 质 体 融 合
（二） 霉菌的原生质体融合
• 简要介绍霉菌（丝状真菌）原生质体融合的基本方法，种 内和种间原生质体融合和融合产物的生化遗传分析，以及 原生质体融合在工业上的应用。
（2） 原生质体的分离、再生和回复
• 直接选择法是将融合原生质体直接接种在
MM或选择性MM上，形成异核体，体内
核迁移融合形成二倍体，用理化因素处理 二倍体孢子，发生核分离和重组，生成包 括重组体在内的高频率分离子，对重组分 离子的细胞大小，核数目和DNA含量，形 态以及分离子标记进行签定和分类。
2. 种内原生质体融合
生物原生质体。
一 微生物细胞融合
• 1972年，匈牙利Ferernczy等首先报道在微生物中的原生 质体融合，他们采用原生质体融合技术使白地霉营养缺陷 型形成强制性异核体。
• 1976年巨大芽抱杆菌、枯草杆菌、裂殖酵母等原生质体融
合取得成功，构巢曲霉和烟曲霉、娄地青霉和产黄青霉等 真菌种间原生质体融合也获得成功。
下阶段原生质体破裂；
• ③混合双亲本，加适量溶菌酶，作用 20~30min；
• ④离心后得原生质体，用少量高渗培养基制成菌悬液；
（二） G+细胞融合的过程
• ⑤加入10倍体积的PEG促使原生质体凝集、融合； • ⑥数分钟后，加入适量高渗培养基稀释； • ⑦涂接于高渗选择培养基上进行筛选。 • 长出的菌落很可能已结合双方的遗传因子，要经数代筛选 及鉴定才能确认已获得能稳定遗传的杂合菌株。
的。
三 真菌的原生质体融合
• 真菌主要包括单细胞的酵母类和多细胞菌丝类。 • 降解真菌细胞壁、制备原生质体是融合的关键。 • 真菌的细胞壁成分较复杂，主要由几丁质及各类葡聚糖构 成纤维网状结构，夹杂着少量的甘露糖、蛋白质和脂类。 • 因此可在含有渗透压稳定剂的反应介质中加入消解酶进行
酶解，也可用蜗牛复合酶进行处理，原生质体的得率都在
• ③形成部分异倍体： • 构巢曲霉和烟曲霉融合，种间融合频率比种内至少低5个 级数。异核体或完全异倍体状态极短，故分离不到，异核 体或二倍体状态可能是致死的。互补细胞内含有亲株一方
的完整基因组和另一方的少数染色体，是部分异倍体。在
MM上用菌丝或孢子传代可以长期保持。但在CM上的互 补细胞迅速分离为构巢曲霉或烟曲霉，但双方同不会同时
• 融合原生质体接种到MM或选择性MM平板上再生和回复 成为正常细胞。
（3）原生质体回复
• 细胞壁合成后立即发生细胞分裂，分裂几代后，才能回复 成为正常细胞形态。 • 形态多样化取决于各自细胞分裂方式。当细胞分裂受到干
扰时，会出现各种畸变形态的细胞；不受干扰的细胞分裂，
将回夏成为正常细胞。 • 所有回复体细胞都能保持稳定的传代。
迅速发生染色体分离；赤霉素产生菌具有类似情况。
（2）原生质体融合和重组
• 原生质体融合有低频率的自发融合和高频率的诱发融合， 两者相差几个数量级。诱发融合是以等量原生质体相混合， 以CaCl2作高渗稳定溶液(pH为7)，用PEG融合，取样镜检，
达到最高融合率时，离心洗涤除去大部分PEG-Ca2+。
出现。
• 至今国内外已成功地进行过诸多真菌的种内、种间、
属间的原生质体融合，多为大型食用真菌，如蘑菇、 香菇、木耳、凤尾菇、平菇等，取得了相当可观的经
济效益。
四 微生物细胞工程 研究进展与应用
• （学生综述）
思考题
• 1微生物细胞工程的主要研究内容 • 2微生物细胞融合工艺
• 根据细胞壁成分的差异将细菌分成革兰氏阳性细菌和革兰
氏阴性细菌两大类。 • 前者肽聚糖约占细胞壁成分的90％，而后者的细胞壁上除 了部分肽聚糖外还有大量的脂多糖等有机大分子。由此决 定了它们对溶菌酶的敏感性有很大差异。
二 原核细胞的原生质体融合
• 溶菌酶广泛存在于动植物、微生物细胞及其分泌物中。它 能特异地切开肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之 间的β-1，4糖苷键，从而使革兰氏阳性菌细胞壁溶解。
第四节 微生物细胞工程
• 微生物是一个相当笼统的概念，既包括细菌、放线菌这样 微小的原核生物，又涵盖菇类、霉菌等真核生物。 • 由于微生物细胞结构简单，生长迅速，实验操作方便，有
些微生物的遗传背景已经研究得相当深入。
• 现已在国民经济的不少领域，如抗生素以及其他发酵工业、 污染防治与环境保护、灭虫害与农林发展、深开采与贫矿 利用、资源保护与能源再生、种菇蕈造福大众等方面发挥 了非常重要的作用。
第四节 微生物细胞工程
• 微生物细胞工程是指应用微生物细胞进行细胞水平的研究 和生产。 • 具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改变、
微生物细胞的直接利用以及获得微生物细胞代谢产物等。
• 本节仅从细胞工程的角度，概述通过原生质体融合的手段 改造微生物种性、创造新变种的途径与方法。
第四节 微生物细胞工程
敏感程度也不一样。芽孢杆菌对溶菌酶的敏感性大于棒状杆
菌。在棒状杆菌制备原生质体前，菌体前培养需要添加少量 青霉素以阻止肽聚糖合成过程中的转肽作用，从而削弱细胞
壁对溶菌酶的抗性。
二 原核细胞的原生质体融合
• 细菌是最典型的原核单细胞生物，细胞外有一层成分不同、 结构相异的坚韧细胞壁，形成抵抗不良环境因素的天然屏 障。
• 由于革兰氏阴性细菌细胞壁组成成分的差异，处理革兰氏
阴性菌时，除了溶菌酶外，一般还要添加适量的EDTA(乙 二胺四乙酸)，才能除去它们的细胞壁，制得原生质体或 原生质球。
（一） PEG融合示意图
（二） G+细胞融合的过程
• ①分别培养带遗传标志的双亲本菌株至细胞壁最易被降解 指数生长中期； • ②分别离心收集菌体，用高渗培养基制成菌悬液，以防止
• （1）异核体形成：
• 营养标记互补的原生质体融合，导致异核
体形成。异核体产量取决于融合频率，
Ca(NO3)2或CaCl2和低浓度PEG于pH则可
获得优良结果。
• 异核体发展产物有以下几种。
• ①形成异核体和偶见的稳定二倍体——曲霉和青霉属的一
些种是这种异核体的典型代表。 • ②形成异核体和常见的短暂二倍体—— 顶头孢霉在原生 质体融合中容易产生高频率的异核体，但异核体极不稳定， 只分离到极少数杂合原养型茵落，二倍体阶段相当短暂，
90％以上。此外还有纤维素酶、几丁质酶、新酶等。
三 真菌的原生质体融合
• 真菌原生质体融合的要点与前述细胞融合类似，多以PEG 为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。 • 但真菌多为单倍体，只有形成真正单倍重组体的融合子才
能稳定传代；杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳
定，需经多代考证才能最后断定是否为真正的杂合细胞。
（一） 微生物细胞融合工艺
菌种选择 扩大培养 大量菌体细胞 ①高渗溶液 (SMM液、DP液) ②脱壁酶 (蜗牛酶、溶菌酶)
去融合剂 融合剂(PEG) 融合原生质体 原生质体融合 原生质体 培养基
细胞壁再生
菌落繁殖
融合体筛选
（二） 影响微生物细胞融合的因素
• 微生物原生质体融合受下列因素的影响： • ①参与融合菌株的遗传性状。 • 参与融合的菌株一般都需要有选择标记，标记主要通过诱变获得。在
• 1. 霉菌原生质体融合方法
• 2. 种内原生质体融合
1. 霉菌原生质体融合方法
• （1）亲株的选择和标记： • 由于原养型亲株特性的多样化，选择不同特性的亲株进行融 合很有必要，例如：选择一株高产(或优质)、孢子形成率少或 生长速率缓慢；与另一株低产(或劣质)、孢子形成率多或生长 速率快的两菌株进行融合，很有希望获得高产(或优质)和孢子 形成率多或生长快速的融合产物。
一 微生物细胞融合
二 原核细胞的原生质体融合
三 真菌的原生质体融合
四 微生物细胞工程研究进展
一 微生物细胞融合
• 早在1958年，冈田善雄发现，用紫外线灭活的仙台病毒可 以诱发艾氏腹水瘤细胞融合产生多核体。 • 微生物细胞壁是细胞融合的一道天然屏障，要使不同细胞
遗传信息发生重组就需要除去细胞壁。不少人尝试制备微
一种菌落形态正常，在CM上有选择地产生营养缺陷的娄 地青霉孢子；第二种菌落是由松散网状菌丝组成的异常形
态，在CM上亦产生营养缺陷的娄地青霉孢子。第三种菌
落，在MM上形成大的原养型孢子。 • 而用产黄青霉培养条件的三种菌落都能产生与产黄青霉产 生一祥的青霉素，第一和第二种菌落是异核体，第三种菌 落是异倍体或部分异倍体。
• 融合亲抹的标记，对检出融合产物及其精确的遗传分析是必
不可少的。常用的选择性标记，有营养缺陷和药物抗性非选 择性标记，有菌落形态、孢子颜色和特定代谢产物的量或质 等。
（2） 原生质体的分离、再生和回复
• ①原生质体分离：
• 对数生长早期的菌丝体，臵于添加外源溶菌酶的高渗稳定
剂溶液中酶解脱壁，分离并纯化原生质体。 • 例如有效溶解产黄青霉或顶头孢霉的菌丝壁的多糖酶—— 纤维素酶、蜗牛酶、溶解酶L1等，用量为在0.1%~1.0% 之间，于30~33℃处理1~4小时；用0.7M氯化钠或0.6M硫
• 不论近亲或远亲的种间原生质体融合，其频率比种内约 低5个级数。融合产物及其性质可能有下列几种情况： • ①形成异核体和二倍体：构巢曲霉和皱孢曲霉，其融合
产物表现为构巢曲霉种内融合产物的各种特性。
• ②形成异核体和异倍体： • 首先形成异核体，异核体状态稳定，继则核融合。娄地青
霉和产黄青霉融合可得到三种生长缓慢的原养型菌落，第
酸镁作高渗溶液稳定保护原生质体。
• 在此高渗稳定溶液中酶解脱壁，通常可获得高产率的原生 质体。
（2） 原生质体的分离、再生和回复
• ② 原生质体再生： • 所谓再生，即脱壁的球状原生质体，在高渗稳定的再生培 养基上，于培养过程中生长细胞壁，并形成菌丝或菌落。
（2）原生质体的分离、再生和回复
• ③灭活原生质体融合： • 用热、药物和紫外线处理，使一方或双方都灭活的原生质 体进行融合。用产黄青霉的一方原生质体融合前先经紫外
用PEG诱导融合，融合产物可产生较大量青霉素。
• 脂质体可作为遗传物质和其他生物活性化合物或代谢中间 物的载体，通过与原生质体融合而传递。
（2） 原生质体的分离、再生和回复
• ⑤融合产物的选择：
• 间接选择法是将融合原生质体涂布于CM上生长，再 影印于MM或选择性MM上，由于多数融合原生质体 在核融合前就发生分离，成为两亲株标记的分离子， 少数菌落即为异核体并长成二倍体。
进行融合时，应先测定各个标记的自发回复突变率。若回复突变率过
高，则不宜作为选择标记。 • ②制备原生质体的菌龄。
• 制备细菌原生质体应取对数生长中期菌龄的细胞，因为此时的细胞壁
中肽聚糖的含量最低，对溶菌酶也最敏感。
（二） 影响微生物细胞融合的因素
• ③培养基成分。 • 细菌在不同的培养基中培养对溶菌酶的敏感程度不一。培养 用基本培养基比用完全培养基效果更好。 • ④细胞的前处理。 • 由于细胞壁结构的差异，同样是革兰氏阳性菌，对溶菌酶的
（三） G-细胞融合的过程
• 革兰氏阴性细菌，在加入溶菌酶数分钟后，应添
加0.1 mol/L的 EDTA-Na2共同作用15~20min，则 可使90％以上的革兰氏阴性细菌转变为可供细胞
融合用的球状体。
• 尽管细菌间细胞融合的检出率仅在10-5～10-2之间，
但由于菌数总量十分巨大，检出数仍是相当可观