体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂(完整资料).doc

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(完整版)抗氧化试验方法

一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。

1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。

当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。

1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。

1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。

按下列公式计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。

2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。

2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。

抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。

此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。

抗氧化实验方法

2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测2.2.3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定（1）实验试剂的配制DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。

样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。

（2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。

振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。

%100)(0210⨯--=A A A A 清除率式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。

2.2.3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定（1）实验试剂的配制Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。

邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。

样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。

（2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。

抗氧化实验方法

1还本力的测定之阳早格格创做样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐慢冲液（pH6.6）战2ml 1%的铁氰化钾溶液的混同液中.混同物正在50℃保温20min，而后正在反应混同物中加进2ml 10%的TCA，混同后以3000rpm离心10min，与上浑液2ml与2ml蒸馏火以及0.4ml 0.1%氯化铁正在反招考管中反应，10min后测定其正在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还本力越强.注意：修议蛋黑浓度以5mg/ml安排变更，比圆2.5，5之类变更.然而简曲情况应根据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐慢冲液的配制睹附表.铁氰化钾溶液应衰拆正在棕色瓶中.比色皿的用法：可睹光(>400nm)用玻璃比色皿（即不标字母大概者标G的比色皿），紫中光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基扫除活性的测定将1.5ml样品液增加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混同，振荡，正在室温下搁置30min，而后正在波少517nm处检测（Ai）.扫除率估计公式为：空黑为1.5 ml 95%的乙醇加进1.5 ml蒸馏火调整.式中：Ac——对于照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏火正在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇正在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液正在517nm处的吸光值；注意：修议酶解液蛋黑浓度以2mg/ml 安排变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，然而是简曲情况应视扫除率而定，最后截止应有扫除率大于50%战小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴心罩战脚套举止支配.而且DPPH试剂很高贵，用时注意俭朴.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称与0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 正在卵黄磷脂体系中抗氧化本领的测定以卵黄脂蛋黑为底物的LPO模型反应体系包罗:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS慢冲液补脚至2.0mL.对于照管除不加样液中其余试剂共前.将上述2种试管共时置37℃恒温火浴锅中保温培植1h.与出后，加进20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对于照管于3500r/min离心10min，与2.0mL上浑液，分别加进品量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0mL，加塞于100℃火浴15min，与出热却.空黑管以 2.0mLPBS溶液代替，正在532nm下测定吸光度，样品对于卵黄脂蛋黑LPO 的压制率表示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加进样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应搁置冰箱保存.酶解液蛋黑浓度以5mg/ml安排安排，然而简曲应视扫除率大小而定，对于酶解液蛋黑浓度举止安排.硫代巴比妥酸溶液需搁置于棕色瓶内保存.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再正在50℃火浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶衰拆.4 过氧化值的测定参照本食品教院林华娟等教授主编的食品分解真验道义一书籍.5 超氧阳离子自由基扫除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对于照）：对于照组战空黑对于照组加进4ml 蒸馏火（去离子火）战，0.1 mol/LTris-HCl 慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm 处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑对于照管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对于照.（V对于照正在0.05A/min~0.065A/min之间，可则应安排邻苯三酚加进量）样品自氧化速率（V样品）：样品组战空黑组均加进一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式估计样品对于超氧阳离子的压制率：式中：压制率(%)=(V对于照-V样品)/V对于照×100V对于照－对于照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物真验资料：戴自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效验受到多种果素的效率，惟有正在死物体内具备抗氧化做用的物量才搞灵验的扫除体内爆收的自由基，才搞表示出一定的死物活性.由于体中抗氧化测定要领简单支配，周期短，果此评介一种物量的抗氧化效验往往最先采与体中抗氧化体系.然而体中抗氧化体系往往与人体内的死理环境出进太大，许多钻研截止标明采与体中要领评介灵验的抗氧化剂加进人体后却表示不出应有的抗氧化效验，果此抗氧化剂的抗氧化效验正在采与体中要领举止收端评介后应采与动物真验举止体内评介.人体正在仄常死理代开历程中会爆收少量的含氧自由基，如超氧阳离子、羟自由基、过氧化氢等，那些自由基通过自然存留于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维死素E组成的抗氧化系统去与消.果此，正在仄常状态下，体内自由基保护正在一定火仄并处于动向仄稳中，仄常量的自由基对于细胞的死少、团结、解毒等具备有益的效率，正在杀菌、免疫安排等圆里具备主动而要害的意思.然而，随着删龄大概正在某些病理状态下以及肌体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下落，进而引导肌体代开非常十分而骤然爆收洪量活性氧自由基；大概由于肌体抗氧化物量缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的仄稳得常，以致自由基与机的一些死物大分子，如蛋黑量、核酸、脂量等爆收反应，死成洪量氧化物大概过氧化物，并进一步引起细胞牺牲战构制益伤.业已道明，氧化益伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉软化、神经退止性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)熏染等均有稀切闭系.D-半乳糖诱导的亚慢性衰老模型是依照衰老的代开教道修坐的，其体制与糖代开混治[6]、D-半乳糖醇中毒[7]战活性氧自由基过剩有闭；稠稀钻研标明是死物体内含有半乳糖氧化酶，正在催化D-半乳糖时可爆收超氧阳离子自由基(O2·-)战H2O2；如果少久人为天赋予过量D-半乳糖，使肌体战细胞内自由基爆收过量，除了制成构制细胞曲交益伤中，还引导抗氧化酶活力下落战过氧化产品聚集，进而表示出与人类自然衰老相似的死化变更、免疫功能矮下、基果表黑与调控非常十分细胞繁殖力下落及细胞退化性衰变等.有钻研标明，D-半乳糖可落矮人胚肺两倍体成纤维细胞(HBS)，进而使该细胞SOD活力落矮战过氧化产品MDA删加，进而起到加速细胞老化的效率.本文正在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋黑酶解物具备体中抗氧化活性，然而其正在死物体内的效率效验尚不领会.为此本章采与D-半乳糖诱引导衰老小鼠动做模型，分别以小鼠的血浑、肝净战心净构制中的丙两醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苦肽过氧化物酶(GSH-Px)活性动做评介指标，探讨鹰嘴豆蛋黑酶解物正在死物体内的效率，为掀穿鹰嘴豆蛋黑酶解物对于体内过氧化状态的效率，明确其物量前提战相闭体制提供凭证.。

抗氧化活性实验方法之欧阳数创编

抗氧化活性实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。

分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min 后，5000r/min离心10min。

取上清液于517nm处测吸光值。

用Vc作为阳性对照。

样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。

2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入 2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。

取出后加入 2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。

取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。

Vc作为阳性对照。

3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm 处测吸光值。

EDTA为阳性对照。

样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+()121100%A AA-=-⨯螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。

4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。

取50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。

体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂

3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：1、所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结

体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结1 总还原力的测定采用Lee等[14]方法,略修改.取1.0 mL浓度为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液,加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6),然后加入2.5 mL 1%六氰合铁酸钾(K3Fe(CN)6), 50℃水浴30 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混匀1 500 g离心10 min,取上清液2.5 mL加2.5 mL水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁混匀,于700 nm处比色测定.以25~200μg/mL维生素C为标准溶液做标准曲线,以维生素C相当含量(mg/g)表示样品总还原力.2 DPPH·自由基清除率的测定采用Yamaguchi等[15]方法,取0.2 mL浓度分别为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液同1.0 mL 95%的DPPH乙醇溶液混匀,于37℃反应60 min后在517 nm处比色.DPPH自由基清除率用以下方程式计算: Y= [(OD517对照-OD517样品)/OD517对照]×100式中:Y为清除率,%;OD517对照为517 nm下对照品的吸光度值;OD517样品为517 nm下不同浓度样品的吸光度值.3 羟基自由基(·OH)清除率的测定桦褐孔菌多酚的羟基自由基(·OH)清除率由改动后的Nicholas Smirnoff[11]法测得。

反应体系(4 mL)包括:1 mL H2O2(8.8 mmol/L),1 mL FeSO4(9 mmol/L),1 mL水杨酸(9 mmol/L),1 mL多酚溶液(0.4mg/mL)。

H2O2最后加入以启动整个反应。

反应体系在37℃条件下温育60 min,在15 000×g条件下离心6 min。

抗氧化测定方法流程

一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋ 2.5mL TPTZ溶液＋ 2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

多肽体外抗氧化

多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法一．实验原理：样品（蝇蛆多肽提取物）将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝（亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3），在700nm 测吸光度值，通过测定吸光度来判断受试物还原力的强弱。

铁氰化钾溶液为黄色，猜测用三氯乙酸（CCL3COOH ）与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀，离心除去，排除对吸光度数值的影响。

二．试剂的配置V1=0.10005585L V2=0.10003205L三．实验步骤；1ml 样液+2.5ml,0.2mol/l磷酸缓冲液（ph6.6）+2.5ml,1%铁氰化钾2.5ml,10%TCA（三氯乙酸）取1ml 上清液+0.2ml,0.1%三氯化铁+1ml 蒸馏水室温反应10min后在700nm处测吸光度多肽的浓度分别为10,20,30,40,50mg/ml四。

结果与分析以质量浓度为横坐标，吸光度值做纵坐标画图，对多肽的总还原能力与VC的总还原能力进行比较。

From:猪皮胶原多肽的体外抗氧化特性研究注意：配置不同浓度的样品溶液梯度，依次加入一定量磷酸缓冲液（保证溶液反应的PH环境，如2.5ml pH=6.6）、一定量浓度的铁氰化钾溶液（2.5ml 1%），混合均匀，将该体系置于一定温度下（比如：50℃,不能过高，不然会使物质失活，适当加热可以保证反应程度和时间）恒温水浴放置一定时间（如20min，以反应充分为宜），取出加入三氯乙酸溶液混匀，置于离心机内3000转离心10min（离心机使用时一定保证对侧样品等重），取一定量上清液于另一试管中，加入蒸馏水和三氯化铁溶液（3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 →Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ，黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中，产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀，即普鲁士蓝，测定吸光度时要摇匀，且普鲁士蓝耐热性在140℃，光照下较稳定，不用避光），混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。

抗氧化测定方法流程

抗氧化测定方法流程一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋2.5mL TPTZ溶液＋2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

抗氧化能力的测定的实验报告

抗氧化能力的测定的实验报告实验报告：抗氧化能力的测定引言：抗氧化能力是指物质对抗氧化剂的抵抗能力，其重要性在于帮助人体抵御自由基的损害。

本实验旨在通过测定不同样品的抗氧化能力，评估其对人体健康的潜在益处。

材料与方法：1. 样品准备：从市场购买五种常见的食材作为实验样品，包括苹果、橙子、胡萝卜、菠菜和绿茶。

2. 样品提取：将每种食材分别切碎，并用乙醇提取其抗氧化物质。

将每种样品放入研钵中，加入适量的乙醇，搅拌均匀，然后用滤纸过滤提取液。

3. 抗氧化能力测定：采用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除法测定样品的抗氧化能力。

将每种样品提取液和已知浓度的抗氧化剂（例如维生素C）混合，反应一段时间后，测定混合溶液的吸光度。

4. 对照组设置：同时设置维生素C的对照组，以验证实验方法的准确性。

5. 数据处理：计算每种样品的抗氧化能力，以吸光度测定值的降低程度表示。

使用统计学方法进行数据分析。

结果：根据实验数据统计与分析，不同样品的抗氧化能力有所差异。

其中，绿茶和菠菜表现出较高的抗氧化能力，吸光度的降低程度较大，显示出较强的自由基清除能力。

苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低，吸光度的降低程度较小。

讨论：本实验结果表明，绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，可能对人体健康具有积极的影响。

然而，需要进一步研究以验证这些食材中的具体抗氧化成分，并了解其作用机制。

此外，实验中使用的DPPH自由基清除法仅是众多测定方法之一，其他方法也可以用于评估样品的抗氧化能力。

结论：本实验通过测定不同样品的抗氧化能力，发现绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低。

这些结果为人们选择健康食材提供了一定的参考依据，但仍需进一步研究来确认这些食材对人体健康的确切益处。

常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li

常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。

当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。

实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。

该DPPH溶液避光保存，4h内用完。

（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

abts抗氧化实验步骤

abts抗氧化实验步骤ABTS抗氧化实验步骤引言：抗氧化实验是研究食物、药物或其他化合物抵抗氧化应激的能力的重要方法之一。

ABTS（2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)）是一种常用的抗氧化实验试剂，通过测定其与自由基的反应来评估物质的抗氧化能力。

本文将介绍ABTS抗氧化实验的步骤。

一、实验前准备1. 准备所需试剂和仪器：ABTS、过氧化氢、乙酸乙酯、磷酸盐缓冲液、离心管、离心机、分光光度计等。

2. 预热分光光度计：将分光光度计设定在所需的波长（通常为734 nm），并预热至稳定状态。

二、制备ABTS溶液1. 称取适量ABTS粉末，并加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后稀释至所需浓度（通常为7 mM）。

2. 加入相同体积的过氧化氢溶液（通常为 2.45 mM），混匀后静置室温下30分钟，使ABTS与过氧化氢反应生成自由基。

三、样品预处理1. 根据需要，将待测样品（食物、药物或其他化合物）制备成适当的浓度溶液。

2. 对样品进行必要的预处理，如过滤、离心等，以去除杂质。

四、测定抗氧化能力1. 取适量ABTS溶液，并加入等体积的样品溶液，混匀后静置室温下反应一段时间（通常为6分钟）。

2. 将反应液倒入离心管中，离心5分钟使样品沉淀。

3. 取上清液，用离心机离心5分钟，以去除残留的样品颗粒。

4. 用预热好的分光光度计测定上清液的吸光度（OD值）。

5. 测定空白对照组，即只加入样品溶液的ABTS溶液的吸光度。

6. 根据所测得的吸光度计算样品的抗氧化能力。

一般来说，吸光度越低，抗氧化能力越强。

五、数据分析1. 计算样品的抗氧化能力指数（TEAC值），通常使用标准曲线法或对照差法。

2. 根据所使用的方法，将样品的TEAC值转化为抗氧化能力指数单位，如mmol TE/100 g。

六、结果与讨论1. 根据实验结果，评估样品的抗氧化能力。

2. 结果的解释应结合样品的特性和实验条件，进行合理的讨论。

结论：ABTS抗氧化实验是一种常用的评估物质抗氧化能力的方法，通过测定样品与ABTS自由基的反应来评估其抗氧化活性。

抗氧化活性实验方法

抗氧化活性真验要领（体中真验）之阳早格格创做1、扫除DPPH 自由基本领的测定称与一定量的DPPH ，用无火乙醇配造成0.04mg/mL 的DPPH 溶液.分别与2mL 分歧浓度（2，4，6，8mg/mL ）的溶液，加进2mL DPPH 溶液，混同匀称，室温搁置30min 后，5000r/min 离心10min.与上浑液于517nm 处测吸光值.用Vc 动做阳性对于照.样品对于DPPH 自由基的扫除率用以下公式估计：DPPH ()1201100%A A A -=-⨯清除率 A 0—2mL 无火乙醇+ 2mL DPPH 溶液的吸光值；A 1—2mL 样品溶液+ 2mL DPPH 溶液的吸光值；A 2—2mL 样品溶液+ 2mL 无火乙醇的吸光值.2、总还本本领的测定正在10mL 离心管中分别加进0.2mol/L pH 6.6的磷酸慢冲液 2.5mL 战分歧浓度（2，4，6，8mg/mL ）的溶液1mL ，加进 2.5 mL 1%铁氰化钾，混同匀称后于50℃ FeCl 3，混匀后静置10min ，正在700nm 处检测吸光值.Vc 动做阳性对于照.3、对于Fe 2+离子螯合本领的测定分别与1mL 分歧浓度（2，4，6，8mg/mL ）的溶液战3.7mL 蒸馏火，加进2mmol/L 的FeCl 2溶液0.1mL 战5mmol/L 的菲洛嗪溶液0.2mL ，25℃火浴10min ，于562nm 处测吸光值.EDTA 为阳性对于照.样品对于Fe 2+的螯合率估计公式如下：Fe 2+()1201100%A A A -=-⨯螯合率 A 0—1mL 蒸馏火代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A 1—样品溶液反应后的吸光值；A 2FeCl 2溶液后的吸光值.4、超氧自由基（O 2-）扫除率的测定采与邻苯三酚自氧化法测定.与50mmol/L Tris-HCl 慢冲液（pH8.2）4.5mL ，置25℃火浴中保温20min ，分别加进1mL 样品溶液战0.4mL 25mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃火浴中反应5min ，加进1mL 8mmol/L HCl 末行反应，于299nm 处测定吸光度（A x ），空黑对于照组以相共体积蒸馏火代替样品.按下式估计O 2-扫除率：O 2-00100%x A A A -=⨯清除率 A 0—空黑对于照液吸光度；A x —样品溶液吸光度.5、羟自由基（•OH ）扫除率的测定利用H 2O 2与Fe 2+2O 2 1mL 、9mmol/L FeSO 4 1mL 、9mmol/L 火杨酸-乙醇溶液1mL ，分歧浓度的样品溶液1mL.末尾加H 2O 2开用反应，37℃反应30min ，以蒸馏火为参比，正在510nm 下测定各浓度的吸光度.思量到样品自己的吸光值，以9mmol/L FeSO 4 1mL 、9mmol/L 火杨酸-乙醇溶液1mL ，分歧浓度的样品溶液1mL 战1mL 蒸馏火动做样品的本底吸支值.按下式估计•OH 扫除率： •OH 001100%x x A A A ⎛⎫-=-⨯ ⎪⎝⎭清除率A 0—空黑对于照液的吸光度；A x —加进样品溶液后的吸光度；A x0—没有加隐色剂H 2O 2样品溶液本底的吸光度.。

抗氧化膜的实验流程

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抗氧化实验方法

2.2.3 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化性[9]
2.2.
3.1 邻苯三酚的自氧化速率的测定
取4.5ml50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）、4.2ml蒸馏水倒入试管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入50μL同样在25℃水浴中预热过的30mmol/L邻苯三酚溶液，迅速摇匀后倒入比色皿，在325nm下每隔30s测定一次吸光度，将其自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，然后计算线性范围内每分钟内吸光度的增加即回归直线的斜率，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白对照，并记录结果。

2.2.
3.2 加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定
严格按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml 的样品液，同时蒸馏水的加入量要分别减去相对应加入的样品液的体积，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白对照，测定各组分溶液吸光度值。

为了验证所提取的蛋白质以及黄酮类物质的抗氧化活性大小，本次实验选用0.05mg/ml的维生素C作为检测的对照。

2.2.
3.3计算清除率
抑制率（%）=（△A1／△t－△A2／△t）／（△A1／△t）×100% 式中：△A1／△t为邻苯三酚自氧化时反应速率[10]
△A2／△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

多肽体外抗氧化总还原力的测定

2.5ml样品+2.5ml1%铁氰化钾+2.5mlPH6.6磷酸盐缓冲液（0.2mol/l）
50℃水浴加热 20min
2.5ml10%TCA
4000r/min 10min
上清液5ml+5ml水+1ml0.1%三氯化铁于700nm处测吸光度值，Vc作对照
注意：配置不同浓度的样品溶液梯度，依次加入一定量磷酸缓冲液（保证溶液反应的PH环境，如2.5ml pH=6.6）、一定量浓度的铁氰化钾溶液（2.5ml 1%），混合均匀，将该体系置于一定温度下（比如：50℃,不能过高，不然会使物质失活，适当加热可以保证反应程度和时间）恒温水浴放置一定时间（如20min，以反应充分为宜），取出加入三氯乙酸溶液混匀，置于离心机内3000转离心10min（离心机使用时一定保证对侧样品等重），取一定量上清液于另一试管中，加入蒸馏水和三氯化铁溶液（3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ，黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中，产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀，即普鲁士蓝，测定吸光度时要摇匀，且普鲁士蓝耐热性在 140℃，光照下较稳定，不用避光），混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。
二．查阅文献以确定多肽浓度
1．多肽浓度与吸光度完全成直线关系的
①
②
③
④
2.多肽浓度与吸光度关系不是成直线的（有一点弧度的）
① 此试验浓度太小，担心结果出不来
② 因此实验浓度梯度太大，槲皮素出现了抛物线式图形，建议在设置我们的实验时浓度梯度大点，可能有助于得到结果
③
此实验浓度小，且子实体多肽变化不明显，即在0.3与0.2相同后有出现上升

抗氧化实验方法

1还原力的测定样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。

混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。

吸光值越大表明还原力越强。

注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。

但具体情况应根据吸光值大小而定。

0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。

铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。

比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。

2 DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。

清除率计算公式为：空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。

式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。

DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。

而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。

0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。

3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。