植物病毒分子检测方法概述

植物病毒分子检测方法概述

邵碧英

(福建出入境检验检疫局　福州　350001)

植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。

CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。

1　以病毒外壳蛋白为基础的检测方法

植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。

111　酶联免疫吸附反应(EL ISA)

EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。

后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。

EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。

112　斑点免疫吸附法

20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。

斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。

113　直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。

鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。

组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。

114　电印迹免疫分析(EBLA)

电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。

EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法

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不适于大量样品的检测。

115　伏安酶联免疫分析法

伏安酶联免疫分析是将酶催化、免疫技术和伏安法检测相结合的一种免疫分析方法。焦奎等[4]已研究10个伏安酶联免疫分析新体系,灵敏度均高于EL ISA 。伏安酶联免疫分析法具备了伏安法的高灵敏度和高准确性,又具备免疫反应的特异性,仪器设备简单,操作方便。但此方法不适宜于大量样品的分析。

116　胶体金免疫法

胶体金颗粒具有高电子密度和能结合生物大分子的特性,将其标记到抗体或SPA 上,再利用抗原抗体反应来检测抗原,增强了可见性,若在金颗粒周围再进行银染色又提高了检测灵敏度。在膜上进行免疫金、免疫金/银染色时分别称为斑点免疫金(Dot 2IGS )和斑点免疫金/银(Dot 2IGSS )染色。魏梅生[5]将Dot 2IGS 和Dot 2IGSS 应用于烟草环斑病毒(Tobaccoring 2spot virus )的检测,还将胶体金颗粒标记TRSV 的抗体,制成了免疫层析检测试条[6],试纸条检测操作简便,不需要任何仪器,10mim 之内即有结果,特别适于田间快速诊断和口岸检疫。117　免疫PCR 新近发展起来的免疫PCR 是将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高录敏度有机结合的检测技术与酶标检测技术相比,免疫PCR 是用DNA 片段取代酶来标记抗体,然后用PCR 扩增DNA 片段从而放大抗原抗体反应,大大提高了检测灵敏度。Sharman [7]建立一种复合免疫PCR ,可同时检测香蕉和车前草粗提取汁液中的香蕉苞叶花叶病毒(Banana bract mosaic virus ,黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒(Banana bumchy top virus )。2　以病毒核酸为基础的检测方法

血清学方法检测植物病毒的优点是灵敏、使用方便,与生物学实验相比节省空间、时间,并且可重复性强,在病毒检测技术方面

是一大进步。但在样品量极少或病毒在组织中含量很低、无蛋白外壳的类病毒的检测时,必须用核酸检测法。211　PCR

PCR 是一种DNA 体外扩增技术,大多

数植物病毒含的是RNA ,首先要将RNA 反转录成cDNA ,后进行PCR ,此方法称为R T 2PCR 。近年来,在R T 2RCR 基础上已经发展了多种方法用于植物病毒的检测。复合R T 2PCR 是在同一R T 2PCR 反应体系中用几对不同的引物同时检测多个目的片段。Nassuth 等[8]应用复合R T 2PCR 同时检测葡萄藤提取物中的4种病毒。Nie 等[9]也应用复合R T 2PCR 技术同时检测了马铃薯的5种病毒和1种类病毒。复合R T 2PCR 和用单一R T 2PCR 做相同数目的病毒检测相比,节约了时间和试剂。

PCR 2EL ISA 是用EL ISA 替代琼脂糖凝胶电泳来检测PCR 产物的方法,录敏度高。Olmos 等[10]用PCR 2EL ISA 方法检测PPV ,

灵敏度比免疫PCR 高100倍。

采用将PCR 和荧光测定相结合的实时荧光定量PCR 不仅可避免假阳性的出现,而且提高了检测灵敏度,还能进行定量检测。Roberts 等[11]用实荧光定量R T 2PCR 可检测少至500fg 的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus.)。Eun 等[12]采用复合荧光定量R T 2PCR 法可同时检测少至5fg 的CymMV 和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot to 2bamovirus )。

PCR 对病毒是的有利条件是它特别灵

敏,可检测最低病毒含量达到fg 水平,可直接对任何材料,包括坏死、鲜活、甚至很微量材料进行检测。但植物病毒多为RNA 病毒,RNA 很容易降解,撮相对困难,只有那些已知序列的病毒才能作PCR ,实验时需要昂贵的试剂和特殊的设备。

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