荧光分析法知识讲解
荧光分析法专题知识
续前
注：
➢ 处于激发态旳电子，经过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态旳最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量互换→振动弛豫
返回
续前 3、体系间跨越（intersystem crossing)
过程：处于激发态旳电子自旋方向发生变化，而使电子能级旳 多重性发生变化旳过程
特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间
1.分子产生荧光必须具有旳条件
（1）具有合适旳构造：构造中有共轭π→ π*产生旳K带，
能吸收紫外-可见光
（2）具有一定旳荧光效率（）： 荧光效率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
➢荧光效率只能为0～1 ➢荧光效率低旳物质可能有强旳紫外吸收，但所吸收旳能量
以无辐射跃迁旳方式释放，不出现荧光发射；
2.分子构造对荧光旳关系 （1）跃迁类型：
三重态：两电子自旋方向相同，自旋量子数分别为 1 和 1
22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1
22 多重性 M 3
续前 基态单重态S0
π*
激发单重态S*
π* π*
激发三重态T
能量
π
π
π
A
B
C
单重态和三重态电子分布
A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态
续前
跃迁类型旳比较
②吸电子基团引入，φ↓（-COOH，-NO2，-Cl 等）， 减弱共轭 程度
③影响不大：-SO3H，-NH3+，-R，对共轭体系作用较小
返回
续前
苯
λex=205nm λem=278nm Φf=0.11
萘
2m86n 3m21n 0.29
荧光分析法
荧光分析法一、基本原理某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescence analysis）。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快（约10-8s）因碰撞而以热的形式损失部分能量，由所处的激发态能级下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
荧光物质的线性范围一般在0.00005-100微克/ml,当荧光物质溶液的吸光度小于或等于0.05时荧光强度和浓度才成线性关系。
荧光分析法
第二节 基本原理
一、荧光与磷光的产生过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
1.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光测量波长(选最大发射波长),测定得到的化合物 发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 图中曲线I
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
2020/6/12
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选
最大激发波长),测定得 到的化合物发射的荧光(
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
2020/6/12
一、荧光与磷光的产生过程
2Hale Waihona Puke 分子能级与跃迁：分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：
吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
2020/6/12 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
第一节 概述
一、什么是荧光？ 当某物质吸收特定波长的光之后，除产
第十一章荧光分析法解析
1. 长共轭结构
能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长 共轭双键的脂肪烃
共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于 产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生
苯
lex 205nm lem 278nm
0.11
萘
lex 286nm lem 321nm
0.29
蒽
lex 356nm lem 404nm
内部能量转换 当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。 （振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
（2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ）
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
S
O
3
- H+
S
O
3
p H = 6 .4 ~ 7 .4 OH
O-
无荧光
蓝色荧光
+ H+ p H = 4.8 ~3.4 NH2
蓝色荧光
N H 3+ 无荧光
苯胺在（ C）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
仪器分析—荧光分析法
一．定义和分类
概述
（1）定义：物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态 的最低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光，根据物
质的光谱线位置及其强度进行物质原子荧光分析法 2．分子荧光分析法
优点：测定灵敏度高、选择性好 如紫外-可见分光光度法 10-7g/ml, 荧光分析法 10-10～10-12g/ml
• 简称内转换，是与荧光相竞争的 过程之一。当两个电子能级非常 靠近以致其振动能级有重叠时， 内转换特别有效。内转换的速度 很大程度上决定于此过程所包含 的能级之间相对能量差。
3．外部能量转换（external conversion）
• 简称外转换，是与荧光相竞争的主要过 程。外转换是激发态分子与溶剂分子或 其它溶质分子的相互作用及能量转移， 使荧光强度减弱甚至消失，这些过程统 称为外转换过程。这一现象也称为荧光 熄灭或荧光淬灭。从第一激发单线态或 三线态回到基态的无辐射跃迁(图14-2)可 能既涉及内转换也涉及外转换等。
（二）激发光谱与荧光光谱的形成
任何荧光物质，都具有两种特征 光谱，即激发光谱(excitation spectrum) 和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。
1. 激发光谱
保持荧光发射波长不变（即固定发 射单色器），依次改变激发光波长（即 调节激发单色器），测定不同波长的激 发光激发下得到的荧光强度F（即激发光 波长扫描）。然后以激发光波长为横坐 标，以荧光强度F为纵坐标作图，就可得 到该荧光物质的激发光谱。
• 利用某些物质的荧光在辐射停止后仍可持续 一段时间的性质，建立了时间分辨荧光法， 减少或消除了激发光的干扰，大大提高了灵 敏度（达10−19g）。
（三）无辐射跃迁
化学分析技术中的荧光法
化学分析技术中的荧光法荧光法是化学分析技术中常用的一种方法，其基本原理是利用物质吸收能量后产生的激发态分子的自发辐射。
荧光法具有高灵敏度、高选择性、快速、非破坏性等优点，因此在分析领域中得到了广泛应用。
一、荧光现象荧光现象是很多物质在受激光照射或吸收其他电磁波后，从基态跃迁到激发态，再从激发态衰减到基态时，自然辐射出的光现象。
其光谱分布与吸收光谱不同，一般在较长波长处产生。
荧光的激发带宽度很大（可以从两纳米到上百纳米），且激发光对物质的化学性质影响较小，因此在分析领域中具有独特的优势。
二、荧光分析法1. 直接测量法荧光分析法一般分为直接测量法和间接测量法两类。
直接测量荧光分析法中，荧光物质为测量对象，测量时将激发光辐射到样品中，测量样品发出的荧光强度，然后通过与标准曲线比较，可以计算出样品中荧光物质的浓度。
直接测量荧光分析法具有快速、灵敏度高、稳定性好等优点。
但它也面临着无法消除因测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号等问题。
2. 间接测量法另一种荧光分析法是间接测量法。
它是通过荧光物质与已知物质的相互作用来测定未知物质的量。
例如，糖类物质可以被邻苯二甲酸酐（PA）酰化成PA-糖酐，这种物质能够与荧光比爱琴素（ANS）结合产生荧光，而且糖酐的数量与荧光信号的强度成正比。
通过对标准曲线的制备，可以计算出未知糖酐的浓度。
间接测量荧光分析法的优点是可以避免测量系统的几何位置和分析效果差异而引起的扰动信号的干扰，但它也存在某种程度上的样品处理和校准难度大的问题。
三、荧光分析在生命科学中的应用荧光分析方法在生命科学领域中已经得到了广泛的应用，例如，在生化学、免疫学、细胞、化学生物学等各个领域。
在免疫学中，荧光抗体标记技术被广泛用于检测蛋白质和微生物。
常用的标记染料包括荧光素和菲罗达胺等。
荧光分析方法还能够用于细胞成像和病理学分析。
蛋白质标记生物发光剂（luciferase）能够被转染到细胞内，进而检测细胞中的信号通路或者探究细胞蛋白质之间的交互作用。
第四章荧光分析法。
重态的最低振动能级。
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
能
S1*
T2* T1*
量 吸 收
发 射
外转换
荧
发
射 振动弛豫 磷
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互 作用而转移能量的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 6、系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射 跃迁。
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
三、荧光与分子结构的关系
（一）荧光效率 （二）荧光寿命 （三）分子结构与荧光的关系
电子激发态的多重态 M=2S+1
（二）荧光的产生
内转换
振动弛豫
内转换
系间跨越
S2*
S1*
T2*
能
T1*
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0 l 1
l 2 l 2
l3
（二）荧光的产生
处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射 跃迁的形式释放多余能量而返回基态。 辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。 无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、 内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
（二）荧光的产生
1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态
（多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2 的荧光。
分析化学第十一章荧光分析法
由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，故三重 态的能级比单重态的能量略低。
每个电子能级都有ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ个振动能级，在同一个电子 能级中，最低的线代表该能级的振动基态。
吸收过程发生在10-15s左右的时间内。
分析化学第十一章荧光分析法
分子吸收和发射过程的Jablonski能级能级图
由分子多重性的定义有M=2S+1=1,称之为单
重态。 基态单重态以S0表示，S1和S2则分别代表分
子的第一和第二激发单重态。 当分子处于激发态时，若分子的电子自旋与
基态相同，仍然是单重态，即分子处于S1和S2。
分析化学第十一章荧光分析法
在激发态中，分子的某个电子也有可能改变自 旋，即自旋平行则S=1，所以多重性M=2S+1=3,分子 处于这样的激发态称为三重态，
体系的荧光增强；反之，则使体系的荧光减弱。
分析化学第十一章荧光分析法
三、荧光的激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激 发光谱和荧光光谱。 ⒈荧光激发光谱
激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波
长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系
分析化学第十一章荧光分析法
㈡荧光效率
荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与 总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的 荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。
f
发 射 荧 光 的 光 子 数 吸 收 激 发 光 的 光 子 数
荧光的去激发过程：
①发射荧光返回基态(强的荧光物）
②无辐射跃迁回到基态(低荧光物质)
分析化学第十一章荧光分析法
⑹磷光发射 激发态分子经过系间跨越到达激发三重态
第四章荧光分析法
N O Al/3 8-羟基喹啉－铝
N OH 8-羟基喹啉
弱荧光物质
强荧光物质，
4.取代基效应
①给电子基团 -OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等，由 于p－π共轭，增加了π电子的共轭程度，使荧光强度增大， 荧光波长长移。
级的分布。
基态中振动能级的分布和第一电子激发态中 振动能级的分布情况是类似的。 因此荧光发射光 谱的形状和荧光激发光谱的形状极为相似。
蒽的能级跃迁
激发光谱：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4) 荧光光谱：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)
荧光光谱与激发光谱的镜像关系 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
经振动驰豫到 T1最低振动能级，从T1最低振动能
级回到基态S0的各个振动能级所发射的光叫磷光。 磷光的波长比荧光还要长。 磷光发射的持续时间为10－4 ～10S左右，故 外部激发光源停止照射后，磷光还会持续一段时 间。 在室温下能产生磷光的物质很少，故磷光分 析法的应用不如荧光分析法广泛。
2.无辐射跃迁：振动弛豫（VR）、内部转化
级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相
重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦
合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 处于各高激发单重态的电子，都可以通过一系 列内转移及振动弛豫，回到第一激发单重态的最低 振动能级。
(3) 系间跨越（Intersystem Conversion，ISC） 当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，
第四章
荧光分析法
某些物质吸收一定的光能后，电子从基态跃迁 到激发态，然后以光辐射的形式从激发态回到基态， 这种现象称为光致发光，包括荧光和磷光。在荧光
荧光分析法基本概念
荧光分析法基本概念荧光分析法是一种基于物质发射和吸收荧光现象的分析技术。
荧光是指物质吸收电磁辐射后，经激发而发出的光辐射。
荧光分析法利用物质在激发射线的激发下产生的荧光进行定性和定量分析。
它具有高灵敏度、高选择性和高准确性等优点，广泛应用于化学、生物、医学、环境等领域。
荧光原理：荧光原理是指物质在吸收电磁波能量后，部分或全部转化为光能并发出荧光。
荧光的激发和发射有两种机制：分子吸收电磁辐射后跃迁到激发态，然后再从激发态返回基态释放能量发光；分子之间发生能量传递，从激发的分子接收能量并转化为荧光发射。
荧光分析原理：荧光分析技术基于物质的荧光性质。
荧光分析法通过测量物质在特定激发光激发下产生的荧光强度或荧光寿命，来获取物质的信息。
荧光分析法包括荧光光谱分析和荧光寿命分析。
荧光光谱分析：荧光光谱分析是指根据物质在激发下发射的荧光光谱特性来进行定性和定量分析。
荧光光谱是物质荧光发射的光波长与相应的荧光强度之间的关系。
通常，物质的荧光光谱有较为特征的波长范围和特定的峰。
荧光寿命分析：荧光寿命是指物质从激发态到基态的转变所需的平均时间，也称为物质的荧光衰减曲线。
荧光寿命分析利用物质的荧光寿命来进行定性和定量分析，可以通过测量荧光寿命来确定物质的存在和浓度等信息。
常见的荧光分析方法有荧光光谱仪、荧光显微镜、荧光染料、荧光标记等。
荧光光谱仪是荧光分析的重要工具，可以测量物质的荧光光谱，并通过荧光光谱来判断物质的性质和含量。
荧光显微镜是利用物质的荧光特性来观察样品的工具。
荧光染料是一种通过吸收和发射荧光的物质，常用于生物分子的标记和显色。
荧光标记是一种将荧光染料或荧光物质与分析物相结合，通过测量标记物的荧光特性来进行定性和定量分析。
荧光分析法在化学、生物、医学和环境等领域有广泛应用。
在化学分析中，荧光分析法可以用于分析确定荧光染料的结构、测定荧光染料的含量和纯度等。
在生物和医学领域，荧光分析法可以用于检测和定量分析蛋白质、核酸、细胞和微生物等生物分子和生物体。
第十一章 荧光分析法
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
荧光光谱分析法121220讲解
2008年诺贝尔化学奖
2
某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间 内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较 短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿 物 萤石(fluospar)而得名。
我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光
和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光
。
除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子Hale Waihona Puke 第一激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
6
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进 行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相
应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
12
小结：激发单重态与激发三重态的不同 激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性； 激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
化学荧光分析的方法
化学荧光分析的方法化学荧光分析是一种基于样品发出的荧光信号来定量或定性分析化合物的方法。
它利用分子在吸收辐射能量后，再通过荧光发射辐射能量的特性，来对化合物进行检测和分析。
一、荧光分析原理化学荧光分析利用电子激发态分子吸收能量后，电子会从高能级态返回到基态，释放出荧光。
这种荧光信号的性质（如发射波长、强度等）可以提供有关样品分子特征的信息，从而实现对化合物的分析。
二、荧光分析仪器1. 荧光光源：荧光分析需要有足够的激发光源，可以是氙灯、汞灯等。
这些光源具有较窄的光谱带宽，以及较高的光强度，可以提供足够的激发光能量。
2. 荧光检测器：荧光信号的检测通常使用荧光光谱仪或荧光探测器。
荧光光谱仪可以同时记录荧光强度和波长分布，而荧光探测器则主要用于定量测定。
3. 光学系统：光学系统用于控制和聚焦光源对样品的照射，以及将发射的荧光信号收集和传递给荧光检测器。
透镜、滤光片等是光学系统中常用的光学元件。
三、荧光分析方法1. 直接比较法：利用荧光信号的强度与样品中化合物的浓度之间的线性关系，通过比较待测样品的荧光强度与标准品的荧光强度来定量测定待测样品中化合物的浓度。
2. 标记法：将化合物与染料或荧光探针进行标记，并通过检测标记物的荧光信号来定性或定量分析样品中的目标化合物。
标记法常用于生物样品中的分析，如荧光原位杂交技术、荧光免疫分析等。
3. 时间分辨法：利用荧光信号的发光寿命差异来对化合物进行分析。
时间分辨荧光分析通常需要荧光寿命测量仪器和较长的寿命荧光探针，适用于复杂的样品基质。
四、荧光分析的应用1. 生物医学领域：荧光标记的抗体、分子探针等用于细胞成像、病毒检测、蛋白质定量等。
2. 环境监测：利用荧光分析方法对环境样品中的有机污染物、重金属等进行快速分析和监测。
3. 食品安全：荧光分析可用于食品中有害物质的检测，如农药残留、毒素等。
4. 药物研发：荧光分析在药物代谢、药物相互作用等方面具有重要应用价值。
荧光分析法知识讲解
荧光分析法荧光分析法●习题精选一、选择题（其中1~6题为单选，7~10题为多选）1．下列化合物中荧光最强、发射波长最长的化合物是( )。
A. B.C. D.2．所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光( )。
A. 波长长的光线；B. 波长短的光线；C. 能量大的光线；D. 频率高的光线3．单光束荧光分光光度计的光路图是( )。
A.B.C.D. 4A. 1-氯丙烷；B. 1-溴丙烷；C. 1-碘丙烷；D. 1,2-二碘丙烷5．下列化合物荧光最强的是( )；磷光最强的是( )。
Cl BrA B C D I6．下列化合物荧光量子产率最大的是( )A B C DCOO H-COO O -O OH COO HO OH O OCOO -O -O -7．下列说法正确的是( )A 荧光发射波长永远大于激发波长B 荧光发射波长永远小于激发波长C 荧光光谱形状与激发波长无关D 荧光光谱形状与激发波长有关8．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是( )A. 单色光；B. ECl ≤0.05；C. 入射光强度I 0一定；D. 样品池厚度一定9．下列化合物中可产生荧光的化合物是( )A BC DNN N N10．在相同条件下，荧光、延时荧光、磷光三者波长之间的关系为( )A. 荧光波长与延时荧光波长相等；B. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长；C. 磷光波长与延时荧光波长相等；D. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长短二、填空题1．荧光寿命与延时荧光寿命相比，寿命短；荧光寿命与磷光寿命相比，寿命长；磷光寿命与延时荧光寿命相比，二者。
2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状，常形成。
3．一般情况下，溶液的温度，溶液中荧光物质的荧光强度或荧光量子产率越高。
4．激发光谱的形状与光谱形状极为相似，所不同的只是。
5．荧光分光光度计中光源与检测器呈角度。
这是因为。
6．紫外分光光度计与荧光分光光度计的主要区别是（1）。
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荧光分析法荧光分析法●习题精选一、选择题（其中1~6题为单选，7~10题为多选）1．下列化合物中荧光最强、发射波长最长的化合物是( )。
A. B.C. D.2．所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光( )。
A. 波长长的光线；B. 波长短的光线；C. 能量大的光线；D. 频率高的光线3．单光束荧光分光光度计的光路图是( )。
A.B.C.D. 4A. 1-氯丙烷；B. 1-溴丙烷；C. 1-碘丙烷；D. 1,2-二碘丙烷5．下列化合物荧光最强的是( )；磷光最强的是( )。
Cl BrA B C D I6．下列化合物荧光量子产率最大的是( )A B C DCOO H-COO O -O OH COO HO OH O OCOO -O -O -7．下列说法正确的是( )A 荧光发射波长永远大于激发波长B 荧光发射波长永远小于激发波长C 荧光光谱形状与激发波长无关D 荧光光谱形状与激发波长有关8．荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是( )A. 单色光；B. ECl ≤0.05；C. 入射光强度I 0一定；D. 样品池厚度一定9．下列化合物中可产生荧光的化合物是( )A BC DNN N N10．在相同条件下，荧光、延时荧光、磷光三者波长之间的关系为( )A. 荧光波长与延时荧光波长相等；B. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长；C. 磷光波长与延时荧光波长相等；D. 磷光波长比荧光波长、延时荧光波长短二、填空题1．荧光寿命与延时荧光寿命相比，寿命短；荧光寿命与磷光寿命相比，寿命长；磷光寿命与延时荧光寿命相比，二者。
2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状，常形成。
3．一般情况下，溶液的温度，溶液中荧光物质的荧光强度或荧光量子产率越高。
4．激发光谱的形状与光谱形状极为相似，所不同的只是。
5．荧光分光光度计中光源与检测器呈角度。
这是因为。
6．紫外分光光度计与荧光分光光度计的主要区别是（1）。
（2）。
7．荧光分光光度计中，第一个单色器的作用是，第二个单色器的作用是。
8．荧光量子产率，荧光强度越大。
具有分子结构的物质有较高的荧光量子产率。
9．处于激发态的分子不稳定，回到基态时常有、去活化过程。
10．选择适当的可以消除或减少散射光对荧光测定的干扰。
三、判断题1．荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱。
2．荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。
3．溶剂的拉曼光波长与被测溶质荧光的激发光波长无关。
4．在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。
即：KcF 。
5．荧光光谱的形状与激发波长有关。
选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。
6．荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光路为一条直线。
7．发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移伴随电子自旋的改变。
8．紫外分光光度法和荧光分光光度法都属于分子光谱法范畴，所以两种方法具有相同的灵敏度。
9．荧光量子产率φF＜1。
10．具有π→π*跃迁共轭的化合物，易产生更强的荧光；具有n→π*跃迁共轭的化合物，易产生更强的磷光。
四、名词解释1．单重态或单线态2．三重态或三线态3．振动弛豫4．内部能量转换5．荧光6．外部能量转换7．体系间跨越8．磷光9．延时荧光10．激发光谱11．荧光光谱12．荧光寿命13．荧光效率五、计算题1．用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取供试品20片（每片含炔诺酮应为0.54~0.66 mg，含炔雌醇应为31.5~38.5 μg），研细，用无水乙醇溶解，转移至250 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，滤过，弃去初滤液，取续滤液5.00 mL，稀释至10 mL，在λex285nm和λem307 nm处测定荧光强度。
已知炔雌醇对照品乙醇溶液的浓度为1.4 μg/mL，在同样测定条件下，测得荧光强度为65，则合格片的荧光读数应在什么范围内？2．用酸处理1.00 g谷物制品试样，分离出核黄素及少量无关杂质，加入少量KMnO4，将核黄素氧化，过量的KMnO4用H2O2除去。
将此溶液移入50 mL容量瓶中，稀释至刻度。
吸取25 mL放入样品池中以测定荧光强度（核黄素中常含有发生荧光的杂质叫光化黄）。
事先将荧光计用硫酸奎宁调至刻度100。
测得氧化液的读数为6.0格。
加入少量连二亚硫酸钠（Na2S2O4），使氧化态核黄素（无荧光）重新转化为核黄素，这时荧光计读数为55格。
在另一样品池中重新加入24 mL被氧化的核黄素溶液，以及1 mL核黄素标准溶液（0.5 μg/mL），这一溶液的读数为92格，计算试样中核黄素的质量分数（μg/g）。
3．今有化合物SPQ，其分子结构式如下图所示。
该分子可作为选择性的细胞内Cl-离子荧光探针，因为Cl-可碰撞淬灭SPQ荧光。
已知没有淬灭剂存在下SPQ的寿命为26.3 ns。
H3NCH2CH2CH2SO3-现有实验数据测定如下：[Cl-]/mmol/L 0 5 15 50发光强度F 1.0 0.6 0.34 0.15①根据Stern－Volmer方程，利用表中的数据确定Cl-的淬灭常数。
②假设血清中细胞内的Cl-平均浓度为103 mmol/L，则该血清中SPQ的荧光寿命和荧光相对强度各是多少？③如果Cl-浓度降低到75 mmol/L，SPQ的荧光寿命和荧光相对强度又是多少？●习题答案与解析一、选择题（其中1~6题为单选，7~10题为多选）1．D。
因为共轭体系越长、刚性或共平面性越好、离域电子数越多，荧光强度（荧光效率）越大，荧光波长红移程度越大。
所以荧光最强、发射波长最长的化合物是D。
2．A。
由于荧光发射是要经过振动弛豫、内转换损失了部分能量，荧光能量小于激发光能量，故荧光波长总比激发光波长要长。
3．B。
因为（1）荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成。
（2）荧光分光光度计光源必须与检测器垂直。
（3）荧光分光光度计在样品池前后各一个单色器。
单色器1是将光源发出的复光变成单色光；单色器2是将发出的荧光与杂散光分离，防止杂散光对荧光测定的干扰。
4．A。
在含有重原子的溶剂中，由于重原子效应（重原子效应是指在含有卤素取代基化合物存在时，随着卤素原子序数的增加，荧光化合物荧光强度降低的现象。
），增加了体系间跨越，使荧光强度减弱。
原子序数越大，重原子效应越严重。
所以，萘及其衍生物在1-氯丙烷中能产生最大荧光。
5．D,C。
由于重原子效应，A、B、C化合物不易产生荧光，易产生磷光。
卤素原子序数最大，重原子效应越严重，荧光熄灭越严重，磷光产生的几率越大。
D没有重原子取代，易产生荧光。
所以，下列化合物荧光最强的是D；磷光最强的是C。
6．B。
因为共平面性越好、离域电子数越多，荧光量子产率越大。
A和C共平面性差，几乎没有荧光，B、D由于苯环之间有氧桥键连接，很好的共平面，所以B、D 都有较大的荧光量子产率，但由于B的-OH和-COOH发生电离，形成-O-和-COO-负离子，离域电子数增加。
而D没有电离，离域电子数相对较少。
所以下列化合物荧光量子产率最大的是B。
7．AC。
由激发光谱和发射光谱特征可知：在溶液中，分子荧光波长总是大于激发光波长。
荧光光谱的形状与激发波长无关。
所以正确说法是AC。
8．ABCD。
荧光强度与荧光物质浓度的关系为F=Kc。
满足F=Kc公式的条件：（1）入射光为单色光；（2）Ecl≤0.05；（3）入射光的强度I0一定；（4）样品池厚度一定。
9． BD。
因为共平面性好的刚性分子才能产生荧光。
A和C共平面性差，不产生荧光，B、D由于苯环之间成环，可以很好的平面，刚性增强。
所以B、D可以产生荧光10． AB。
由荧光、延时荧光、磷光的产生机理可知：荧光波长与延时荧光波长相等；磷光波长比荧光波长、延时荧光波长长。
二、填空题1．荧光；磷光；相等2．镜像对称3．越低4．吸收；激发光谱的纵坐标为荧光强度，而吸收光谱的纵坐标为吸光强度5．90°；如果光源与检测器在同一直线上，透射光将干扰荧光的检测。
6．（1）紫外分光光度计的光源与检测器在一条直线上，荧光分光光度计的光源与检测器呈90°角。
（2）紫外分光光度计有一个单色器；荧光分光光度计在样品池前后各有一个单色器。
7．扫描激发光谱（将光源发出的复光变成单色光）；扫描发射光谱（将发出的荧光与杂散光分离，防止杂散光对荧光测定的干扰）8．越大；刚性、共平面共轭体系9．辐射跃迁（荧光和磷光）；非辐射跃迁（振动弛豫、内转换、系间跨越等）10．激发波长三、判断对错1．×。
由于溶剂极性对荧光化合物π→π*跃迁能级差的影响，同一物质在不同溶剂中的荧光光谱形状和强度都有差别。
溶剂极性的越大，π→π*跃迁能级差越小，荧光波长红移，且强度增强。
2．√。
由荧光激发光谱和发射光谱的产生机理可以看出，（1）激发光谱和发射光谱互为逆过程，并相差固定的能级差。
（2）激发波长跃迁几率大的能级，便是其荧光发射几率大的能级。
所以，荧光光谱与激发光谱之间存在呈“镜像对称”关系。
3．×。
同一溶剂在不同的激发光波长照射下，其拉曼光的波长不同，即溶剂拉曼光频率随激发光频率的变化而变化，当拉曼光处在被测溶质荧光波长附近时，则对荧光溶质的测定产生干扰。
消除的方法有：（1）选用高分辨率的仪器；（2）对所选溶剂的拉曼光谱进行测定，然后对被测化合物荧光光谱进行校正或重新选择被测化合物的激发波长。
由此可见，溶剂的拉曼光波长与被测溶质荧光的激发光波长有关。
4．×。
在一定条件下，物质的荧光强度与该物质在低浓度时呈线性关系。
因为公式F 成立的条件之一是：Ecl≤0.05。
Kc5．×。
无论荧光化合物被激发到电子的哪个激发态，荧光光谱总是由电子的第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级扫描得到荧光光谱。
由此可见，荧光光谱的形状与激发波长无关。
6．×。
为了消除透射光对荧光测定的干扰，荧光分光光度计的光源必须与检测器垂直。
7．√。
分子受激发后，分子外层电子由能级的基态单重态（S ）跃迁到激发单重态（S *）的各个振动能级。
然后通过振动弛豫、内转换回到第一激发单重态的最低振动能级，以辐射形式回到基态的各个振动能级，这时发射的光称为荧光；分子受激发后，由能级的基态单重态（S ）跃迁到激发单重态（S *），通过内转换、振动弛豫和体系间跨越，回到三重态（T *）的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级，这时发射的光称为磷光。
S→S *没有电子自旋的改变； S →T *伴随电子自旋的改变。
所以，发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移伴随电子自旋的改变。
8．×。