第4章优良菌种选育

但是自然选育的效率低，因此经常与 诱变选育交替使用，以提高效率。
4.2 诱变选育
微生物其自身代谢过程是被严格调控的， 所有的代谢产物都不会过量积累，并且还 存在着代谢产物的分解途径。
因此从自然环境中分离的菌种的生产能 力有限，一般不能满足生产的实际需要。
诱变育种是提高菌种生产能力，使所需 要的某一特定的代谢产物过量积累的有效 方法之一。
4.2.1 诱变育种的原理
诱变育种的理论基础是基因突变，突变 主要包括染色体畸变和基因突变两大类。
诱变育种:就是利用各种物理化学诱变剂 处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌 种。
常用的诱变剂包括物理、化学和生物的 三大类，见P35 表4-1。
4.2.2 诱变育种的基本方法
4.2.3 突变菌株的筛选
诱变处理后，正向突变的菌株通常为少 数，需进行大量的筛选，才能获得高产菌 株。
通过初筛和复筛后，还要经过发酵条件 的优化研究，确定最佳的发酵条件，才能 使高产菌株的生产能力充分发挥出来。
经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各 样的变异，如营养变异、抗性变异、代谢变 异、形态变异、生长繁殖变异、发酵温度变 异等。
这些技术都为生产提供了优良生产性能的菌种， 本章将对此作一些简要的介绍。
选育优良菌种常用的方法：
自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、 杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术。
优良菌种的衡量标准: 一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的
基本特性：① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨（见教 材P33）。
若此酶是某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的 酶，该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型。
（4）敏感突变
柠檬酸经顺乌头酸酶催化，转化为异柠檬酸。 生产上为了提高柠檬酸的产量，必须抑制顺乌头酸酶 活性，防止异柠檬酸的产生。 氟乙酸可抑制顺乌头酸酶活性，通过诱变处理造成顺 乌头酸酶结构基因的突变，有可能造成酶活力下降，那 么此菌株必然对氟乙酸更加敏感，即不足于抑制野生菌 顺乌头酸酶活力的某一氟乙酸浓度，会对突变型产生抑 制作用。
通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是 通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。
结构类似物与末端产物有相似的结构，能 与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成， 引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物 参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此它 们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的。未 突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而 死亡。抗反馈调节突变菌株则即使在结构类似 物存在下，仍可合成末端产物形成菌落。
如链霉菌基因重组过程如下：
亲本Ⅰ 亲本Ⅱ
混合菌丝
异核体 部分合子
亲本分离子
异核系
重组体
4.3.2.2 放线菌的杂交方法
放线菌的杂交包括混合培养法（图4-2） 、 平板杂交法和玻璃纸转移法三种。
4.3.3 霉菌的杂交育种
在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）
发现准性生殖之后，才证明微生物除了进 行普遍无性繁殖外，还存在着准性生殖过 程。这为这类微生物的遗传学研究和杂交 育种提供了一条有效的方法。
诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
诱变部分成功的关键包括: (1) 出发菌株的选择 (2) 诱变剂种类和剂量的选择 (3) 合理的使用方法
4.2.2.1 出发菌种的选择
用来进行诱变的出发菌种的性能对提高诱变效 果和效率十分重要。应注意下列方面： （1）选择出发菌种应注意诱变出发菌种要有一
定的目标产物的生产能力。 （2）其他生产性能如生长繁殖快、营养要求低、
噬菌体感染的筛选过程也可以反复多次， 使敏感菌株裂解，从中筛选出抗性菌株。
（3）条件抗性突变
条件抗性突变也称为条件致死突变，其中温度 敏感突变常可提高产物的产量。
如适于在中温条件下（如37℃）生长的细菌， 经诱变后获得的温度敏感突变，只能在低于37℃ 的温度下生长。
这主要是因某一酶蛋白结构改变后，在高温条 件下丧失了活力。
自然选育的一般程序是将菌种制成菌 悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落， 再分别测定单菌落的生产能力，从中选出 高水平菌种。
※自然突变可能会产生两种截然不同的 结果,一种是菌种退化而导致目标产物产量 或质量下降;另一种是对生产有益的突。
自然选育是一种简单易性的选育方法， 可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定 生产、提高产量的目的。
4.1自然选育
自然选育:不经人工处理，利用微生物的自 然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多 因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应:是指在自然环境 中存在着低剂量的宇宙射线，各种短波辐射， 低剂量的诱变物质，和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。
在直链式的氨基酸、核苷酸合成中，营养缺陷型 突变株只能积累中间产物，而不能积累终产物。
在分枝代谢途径中，筛选的营养缺陷型突变菌株 是通过解除协同反馈调节，可使另一分枝代谢途径 中的末端产物积累。
遗传障碍不完全突变即渗漏型，是一种酶活性下 降的突变，不是完全丧失酶活性，因它不会过量积 累末端产物，可避免反馈调节，大量积累中间产物， 这种突变菌株在不添加相应物质的基本培养基上长 成很小的菌落。
其杂交技术包括以下步骤：
（1）异核体形成 （2）双倍体的检出 （3）分离子的检出
4.3.4 酵母的杂交育种
酵母菌是双单性微生物，存在着单倍体 和二倍体的生活史，具有孟德尔式的分离 现象，以及a和α交配型。可以利用酵母菌 的双单特性进行杂交育种。
酵母菌的二倍体的生活力较单倍体要强， 生产能力如发酵性能、产酒率等也明显高 于单倍体，因此通过杂交得到二倍体，就 有可能达到育种的目的。
一般来说，诱变率随诱变剂剂量的增 加而提高，但达到一定程度以后，再提高 剂量反使诱变率下降。因此近年来已将处 理剂量从过去的致死率99～99.9%降至70～ 80%，甚至更低。
但诱变剂剂量也不宜过高。高剂量诱变 可导致细胞核发生变异，也可使其他的核 破坏死亡，形成较纯的变异菌落。
并且高剂量会引起难以恢复突变的巨大 损伤，促使变异菌株稳定，不易产生恢复 突变。
（2）抗噬菌体菌株的选育
噬菌体的感染常给工业生产造成巨大的损失。 而且噬菌体很容易发生变异，使对噬菌体原具 有抗性的菌株失去抗性，所以需要不断选育抗性 菌株。 有研究表明，细菌对噬菌体的抗性是基因突变 的结果，这种抗性可以发生在接触噬菌体以前， 与噬菌体的存在与否无关。
抗噬菌体菌株的筛选可采用自然突变和 诱发突变两种方法。
§4 菌种选育
尽管生产菌种最初均是来自于自然界,但天然 菌种的生产性能一般比较低下。优良菌种的选育为 生产提供了各种类型的突变株，大幅度提高了菌种 产生有利用价值代谢产物的水平，还可以改进产品 质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。
特别是基因工程、细胞工程和蛋白质工程等较为 定向技术的发展，使菌种选育技术不断更新，而产生 出众多有价值的微生物工程产品。主要的育种技术包 括： –自然选育 –诱变选育 –抗噬菌体菌种的选育 –杂交育种 –原生质体融合技术 –基因工程技术等
※在这些基因重组的过程中，并不涉及 整个染色体组，所形成的都是部分合子。
在细菌接合中，将带有两个以上不同选择性遗 传标记的两个菌株进行杂交。
细菌的其他方式杂交，如F因子转导、R因子转 移、转化和转导等，都需要出发菌株带有选择性 遗传标记，使杂交菌落容易识别，方便快速筛选。 如：营养缺陷、抗生素抗性、温度敏感、发酵性 能等。
产孢子多且早、对诱变剂敏感。 （3）用作诱变的出发菌种还必须了解它的产量、
形态、生理等方面的情况。 （4）可选择已经过诱变处理的菌种，因为这样
的菌种对诱变剂的敏感性会有所提高。
4.2.2.2 诱变剂的使用方法
在微生物诱变育种中，诱变的方法有单一诱变 剂处理和复合诱变剂处理。
复合诱变剂处理：是指用两种以上的诱变方法 处理菌种。
这些变异的菌种可用各种方法筛选出来。
4.2.3.1 营养缺陷型突变菌株的筛选
营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理 论研究和工业应用意义，已广泛地在氨基酸、核 苷酸生产中获得应用。
在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端 产物不能积累，因此末端产物的反馈调节被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克 服生长障碍，就能使中间产物积累。
4.3.2 放线菌的杂交
• 放线菌与细菌一样都是原核生物，只有一 条环状染色体。
• 但却象霉菌那样以菌丝形态生长，并形成 分生孢子。
• 其基因重组过程近似于细菌，但它们的育 种方法有许多与霉菌相似。
4.3.2.1放线菌的遗传体系和杂交原理
放线菌基本上有以下四种遗传体系：
（1）异核现象 （2）接合现象 （3）异核系的形成 （4）重组体的形成
4.2.3.2 抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变菌株的筛选
末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍 存在的，除了采用筛选营养缺陷型突变菌株，来降 低末端产物的浓度外，更加有效的办法是筛选抗阻 遏和抗反馈抑制突变株。
这两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的 表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时，仍 不断合成这一产物。但其代谢失调的原因不同。
通过杂交还可以：
（1）扩大变异范围； （2）改变产品的产量和质量； （3）甚至创造出新品种。
由于多数微生物尚未发现有性世代，因 此直接亲本菌株应具有适当的遗传标记， 如颜色、营养要求（即营养缺陷标记）、 或抗药性等。
4.3.1 细菌的杂交
细菌的杂交可以通过：
（1）细菌接合 （2）F因子转导 （3）R因子转移 （4）转化和转导等方法促使基因重组
4.3 杂交育种
生产上，长期使用诱变剂处理，会使菌种的生 活能力逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、 代谢减慢、产量增加缓慢。