酶法拆分共轭亚油酸异构体的响应面优化_王卫飞

共轭亚油酸 (Conjugatedlinoleicacids, CLA)是 一系列含有共轭双键 、具有位置异构和几何异构的 十八碳二烯酸的总称 , 作为一种新型的功能性脂肪 酸 , 因其抗癌 、抗动脉粥样硬化 、减肥等众多生理功 能正日益受到人们的关注 [ 1, 2] 。 天然存在的共轭亚 油酸以 c9, t11 -CLA异构体为主 [ 3] , 但含量极少 ;化 学法合成的共轭亚油酸以 c9, t11 -CLA和 t10, c12 -CLA异 构 体 为 主 , 且 两 种 异 构 体 的 含 量 接 近 1∶1[ 4] 。 大量 研究表 明 c9, t11 -CLA和 t10, c12 CLA是具有生理活性的主要异构体[ 5] , 而这两种异 构体有不同的生理活性 , c9, t11 -CLA异构体具有
抗癌 、促进 生长 和提高 免疫 等作 用 , 而 t10, c12 CLA异构体可调节脂肪代谢[ 6] 。 因此 , 进行 CLA异 构体的分离具有非常重要的意义 。
共轭亚油酸异构体分离方wk.baidu.com 主要有低温结晶
法 、尿素结晶法 、酶法等 , 其中低温结晶法和尿素结 晶法虽然操作简单 , 但是产品纯度不高且会引入一 些甲醇或丙酮等有机溶剂 , 而酶法分离具有反应条 件温和 、分离效果较好 、环境友好等特点 。脂肪酶是 一种生物催化剂 , 不同的脂肪酶具有不同的位置选 择性 , 来源于 Candidacylindracea和 Mucormiehei的 脂肪酶 对 C9 双 键具 有选 择性 , Candidarugosa和 Geotrichumcandidum脂肪酶对 c9, t11 -CLA具有较 好的选择性 , 而 Novzyme435对 t10, c12 -CLA具有 较好选择性[ 7] 。
式中 :ERc9, t11 ———酯化率 ; A乙酯 -c9, t11 ———气相色 谱图中 c9, t11 -CLA乙 酯部分的峰面积 ; A脂肪酸 -c9, t11 ———气相色谱图中 c9, t11 -CLA脂 肪酸部分的峰面积 。
t10, c12 -CLA的酯化率按下式计算 : ERt10, c12 =A乙酯 -t10, c12 /(A乙酯 -t10, c12 +A脂肪酸 )× -t10, c12
收稿日期 :2007 -09 -01;修回日期 :2008 -01 -15 基金项目 :广东省科技攻关项目 (2004B20401014, 20 06B13 001 00 5) 作 者简介 :王 卫飞 (1983), 在 读硕 士 , 主要从 事油 脂化学 方 面的研究工作 。 通讯作者 :王永华 , 杨 博 (Tel)020 -87113842。
实 验号
X1
X2
X3 总酯化率 Y/%
1
-1
-1
-1
32.18
2
-1
-1
1
23.59
3
-1
1
-1
37.67
4
-1
1
1
23.83
5
1
-1
-1
19.98
6
1
-1
1
2.69
7
1
1
-1
16.10
8
1
1
1
2.39
9 -1.681 79
0
0
46.63
10 1.681 79
0
0
6.49
11
0 -1.681 79
6
(a.CollegeofLightIndustryandFoodEngineering, b.SchoolofBioscienceandBioengineering, SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou510640, China)
Abstract:Enzymaticfractionationprocessofconjugatedlinoleicacidisomerswasoptimizedbyresponse surfacemethodology.Theoptimalparameterswereobtained:ethanoldosage0.16 g/g(basedonCLA), pH 6.5, temperature26℃.Theesterificationratewas45.8% afterreaction12 hattheoptimalconditions, andthec9, t11 -CLAandt10, c12 -CLAcontentinethylesterwasupto56.22% and21.63%, respectively. Keywords:conjugatedlinoleicacid;lipase;isomers;responsesurfacemethodology
1 00%
式中 :ERt10, c12 ———酯化率 ; A乙酯 -t10, c12 ———气相色 谱图 中 t10, c12 -乙 酯 部分的峰面积 ;
A脂肪酸 -t10, c12 ———气相色谱图中 t10, c12 -脂肪 酸部分的峰面积 。 1.3.3 响应面实验优化反应条件 在本实验室研 究的基 础上 [ 7] , 选取 温 度 、 pH、乙醇 添 加量 (10 g CLA中 )3个因素为自变量 , 以总酯化率为响应值 , 根据中心组合设计原理 , 设计响应面分析实验 , 其因
37
验 , 用以估计实验误差 。 2.2 响应面实验结果分析
通过统计分析软件 SAS8.0进行数据分析 , 建 立二次响应面回归模型如下 :
Y1 =-270.861 + 2.529 288X1 + 73.461 5X2 + 46.712 83X3 - 0.028 461X1 X1 - 0.123 875X1 X2 0.133 906X1 X3 - 5.158 316X2 X2 -0.260 937X2 X3 13.769 2X3 X3
回归分析及方差分析见表 3、表 4, 响应面图见 图 1 ～图 3。
表 3 回归分析结果
变量 回归系数 标准差
t值
P 显著性
X1 2.529 288 1.139 067 -9.232 23 0.000 1 ＊＊ X2 73.461 500 1.139 067 0.361 275 0.725 41 X3 46.712 800 1.139 067 -3.561 16 0.005 171 ＊＊ X1X1 -0.028 460 1.108 852 -2.566 68 0.028 05 ＊ X1X2 -0.123 875 1.488 262 -0.832 35 0.424 645 X1X3 -0.133 906 1.488 262 -0.719 8 0.488 13 X2X2 -5.158 316 1.108 852 -4.651 94 0.000 905 ＊＊ X2X3 -0.260 937 1.488 262 -0.140 26 0.891 236 X3X3 -13.769 200 1.108 852 -7.947 22 0.000 1 ＊＊ 注 :＊为显著 (P<0.05), ＊＊为高度显著 (P<0.01)
摘要 :利用响应面法优化了酶法酯化拆分共轭亚油酸异构体的工艺条件 , 最佳条件为 :乙醇添加量 0.16 g/g(以 CLA为基准 ), pH 6.5, 温 度 26 ℃。 在 此条 件下 , 反 应 12 h后 , 酯 化率 可以达 到 45.8%, 其中乙酯中 c9, t11 -CLA含量达到 56.22%, t10, c12 -CLA的含量达到 21.63%。 关键词 :共轭亚油酸 ;脂肪酶 ;异构体 ;响应面 中图分类号 :TQ641 文献标志码 :A 文章编号 :1003 -7969(2008)04 -0035 -04
正己烷 , 色 谱纯 ;无水 乙醇 , 分析纯 。 HZQ-Q 全温振荡仪 ;TDL-40B台 式离心机 ;惠普 5890 Ⅱ 型气相 色 谱 , 计 算 机 工 作 站 (GC Workstation)为 HP3398AGChemStation;FID检测器 , 载气 N2 , 燃气 H2 , 助燃气空气 。 1.3 实验方法 1.3.1 酶法分离共轭亚油酸异构体 向 50 mL具 塞锥形瓶中 , 依次加入 10 gCLA、一定量的无水乙 醇和 10 mL脂肪酶溶液 (0.1 g的酶溶于 10 mL不同 pH的缓 冲液 ), 然 后置 于一定 温度的 全温振 荡仪 中 , 180 r/min振荡反应 12 h, 离心分离反应混合物 , 取上层油样适量 (3 ～ 5滴 )于样品管内 (预先加适量 无水硫酸钠 ), 加 1 mL正己烷 , 混匀 , 用于气相色谱 分析 。 1.3.2 反应产物脂肪酸组成分析及酯化率计算 利用气相色谱检测反应产物脂肪酸组成 , 色谱分析 条件为 :色谱柱 OV351(60 m×0.25 mmi.d×0.20 μm), 柱前压 137.9 kPa, 载气流速 3 mL/min, 分流 比 1∶30, 进样量 1 μL, 进样口温度 250℃, 检测口温 度 300℃;程序升温 :150 ℃保持 3 min, 5 ℃/min升 温至 220 ℃, 保持 32 min。
总酯化率按下式计算 : ER=A乙酯 /(A乙酯 +A脂肪酸 )×100%
式中 :ER———酯化率 ; A乙酯 ———气相色谱图中乙酯部分的峰面积 ; A脂肪酸 ———气相色 谱图中 脂肪 酸部 分的 峰面 积。
c9, t11 -CLA的酯化率按下式计算 : ERc9, t11 =A乙酯 -c9, t11 /(A乙酯 -c9, t11 +A脂肪酸 )× -c9, t11 100%
素水平编码表见表 1。
表 1 因素水平编码表
编 码
1 0 -1
反应温度 /℃ X1
55 45 35
因 素
反应 pH X2 7.5 6.5 5.5
乙醇添加量 /g X3
2.4 1.6 0.8
2 结果与分析 2.1 响应面实验安排及实验结果
Kobayashi等 [ 8] 人研究表明 , CLA异构体的 酶法拆分效率主要与总 酯化率相关 , 与加酶量 、温 度 、底物配比和反应时间等无关 。 在本实验中 , 选择
Enzymaticfractionationofconjugatedlinoleicacidisomers byresponsesurfacemethodology
WANGWeifeia, WANGYonghuaa, YANGBob, ZHUOMinb, ZHOURongb, ZHANGShuihuaa
2008年第
33卷第
4 期 CH中IN A国OIL S油AN D脂FATS
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油脂化学
酶法拆分共轭亚油酸异构体的响应面优化
王卫飞a, 王永华a, 杨 博 b, 卓 敏b, 周 瑢b, 张水华a
(华南理工大学 a.轻工与食品学院 , b.生物科学与工程学院 , 广州 510640)
18.81
12
0
1.681 79
0
21.23
13
0
0 -1.681 79
10.27
14
0
0 1.681 79
9.10
15
0
0
0
35.90
16
0
0
0
36.20
17
0
0
0
35.70
18
0
0
0
35.40
19
0
0
0
36.10
20
0
0
0
35.83
2008年第
33卷第
4 期 CH中IN A国OIL S油AN D脂FATS
在本实验室研究的基础上 [ 7] , 采用酶法酯化方 法拆分 CLA异构体 , 利用响应面法对酯化反应进行 过程优化 。
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CH中IN A国OIL S油AN D脂FATS
2008
Vol.33
No.4
1 材料与方法 1.1 材料
脂肪酶 LipaseAY“Amano”30, 由日本天野公司 馈赠 ;共轭亚油酸混合液 (CLA, 70.57%:c9, t11 CLA, 32.05%;t10, c12 -CLA, 38.32%;其他 CLA, 0.2%), 实验室自制 。 1.2 主要试剂 、仪器
LipaseAY30进行 CLA异构体的拆分 , 并应用响应面 优化法进行过程优化 。 以 X1 、X2 、X3 为自变量 , 以总 酯化率为响应值 Y, 响应面实验方案及结果见表 2。 实验 号 1 ～ 1 4为析 因 实验 , 1 5 ～ 20为 6个中 心 实
表 2 响应面实验方案及实验 结果