第二节重组体导入受体细胞的原理与技术-Xidian
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指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子 的过程。 转导和转染的区别
转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程。
转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。
（一）转化 （transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation）
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
4. 外植体的培养
3. 电击法（电穿孔法）
纤维素酶 植物细胞 和果胶酶 原生质体
DNA
电击处 理 选择培养
愈伤组织 分化
混合入 电击缓冲
液
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收集 菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
分装、 -70 ℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
重组体导入受体细胞
简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。
10ng载体DNA 100L感受态菌
吸附DNA
On ice混合，静 置30分钟
摄入DNA 42ºC 1.5分钟
2 ℃离心收 集菌体
冰冷的水重悬 菌体
2 ℃离心集菌
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
百度文库
On ice混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器200400
电击转化法
转化
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37 ℃中速震荡60 分钟
加入1mLSOC 培养液
（二） 转 导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转 移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导） 2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等） 3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体的TDNA区，形成重组DNA
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将重组DNA转入含有Vir致病 基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染植 物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 含 有 外 源 目 的 基 因 的 T-DNA 整合到植物细胞基因组中，获 得转基因植株
生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内
原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各
种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.
转化效率高（高于109/gDNA）
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
LB培养受体菌 至OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2℃离心集菌
冰冷的水重悬菌体
少量冰冷的水 重悬
第二节 重组体导入受体细胞的原理 与技术
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
相关概念
1.转化(transformation)
细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。 2.转导(transduction)
以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 3.转染 (transfection)
叶
盘
法
的
在饲养平皿的 滤纸上培养2天
具
体
操
作
2. 基因枪法（gene gun）
又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属 微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。
DNA 1.2m钨弹头 基因枪
吸附
装入
外植体制备
轰击
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细 胞
基因枪
1. DNA微弹的制备
具 体 操 作
（3）PEG介导的原生质体转化
（4）接合转化
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
1、化学转化法
感受态：细菌能从周围环境中吸收 DNA的生理状态称为感受态(competence).
感受态的出现是由于细菌表面出现 许多DNA结合位点，这些位点只能与双 链DNA结合，而不与单链DNA结合。 这 说明完整的双链结构对于转化活性来说是 必要的。
热激
40% 插入外源基因的载体 PEG4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
3. PEG1000转化
PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用 于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA （3）单链转化率高于双链
每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒， 直接被感受态细胞捕获的过程。
与转化无本质区别
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称 转染
体 外 包 装 过 程
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法 4. 电击法
对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶 液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性， 制备感受态细胞。
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
细菌感受态细胞的制备过程
培养大肠 杆菌
OD600至0.30.4
On ice 5-10 min
4℃离心收集 菌
On ice 30 min
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化
酶去壁
CaCl2
酵母
原生质体 PEG 感受态
转 插入外源基因的载体 化
转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受 再生率影响
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl 处理 感受态
热休克法
10-100L转化液涂含抗 菌素的平板
37℃摇1小时
加入1mL LB培 养基
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
平板培养基培养细菌
10-100L转化液
涂于含抗菌素的平板
37℃过夜
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转
化仪的样品池中，两极施加高压电场。 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产
转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA 转移到受体细胞的过程。
转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。
（一）转化 （transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation）
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
4. 外植体的培养
3. 电击法（电穿孔法）
纤维素酶 植物细胞 和果胶酶 原生质体
DNA
电击处 理 选择培养
愈伤组织 分化
混合入 电击缓冲
液
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
4℃离心收集 菌
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
分装、 -70 ℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
重组体导入受体细胞
简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。
10ng载体DNA 100L感受态菌
吸附DNA
On ice混合，静 置30分钟
摄入DNA 42ºC 1.5分钟
2 ℃离心收 集菌体
冰冷的水重悬 菌体
2 ℃离心集菌
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
百度文库
On ice混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器200400
电击转化法
转化
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37 ℃中速震荡60 分钟
加入1mLSOC 培养液
（二） 转 导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转 移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导） 2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等） 3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体的TDNA区，形成重组DNA
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将重组DNA转入含有Vir致病 基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染植 物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 含 有 外 源 目 的 基 因 的 T-DNA 整合到植物细胞基因组中，获 得转基因植株
生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内
原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各
种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.
转化效率高（高于109/gDNA）
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
LB培养受体菌 至OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2℃离心集菌
冰冷的水重悬菌体
少量冰冷的水 重悬
第二节 重组体导入受体细胞的原理 与技术
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
相关概念
1.转化(transformation)
细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。 2.转导(transduction)
以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 3.转染 (transfection)
叶
盘
法
的
在饲养平皿的 滤纸上培养2天
具
体
操
作
2. 基因枪法（gene gun）
又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属 微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。
DNA 1.2m钨弹头 基因枪
吸附
装入
外植体制备
轰击
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细 胞
基因枪
1. DNA微弹的制备
具 体 操 作
（3）PEG介导的原生质体转化
（4）接合转化
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
1、化学转化法
感受态：细菌能从周围环境中吸收 DNA的生理状态称为感受态(competence).
感受态的出现是由于细菌表面出现 许多DNA结合位点，这些位点只能与双 链DNA结合，而不与单链DNA结合。 这 说明完整的双链结构对于转化活性来说是 必要的。
热激
40% 插入外源基因的载体 PEG4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
3. PEG1000转化
PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用 于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA （3）单链转化率高于双链
每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒， 直接被感受态细胞捕获的过程。
与转化无本质区别
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称 转染
体 外 包 装 过 程
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法 4. 电击法
对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶 液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性， 制备感受态细胞。
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
细菌感受态细胞的制备过程
培养大肠 杆菌
OD600至0.30.4
On ice 5-10 min
4℃离心收集 菌
On ice 30 min
用冰冷的 60mMCaCl2重悬
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化
酶去壁
CaCl2
酵母
原生质体 PEG 感受态
转 插入外源基因的载体 化
转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受 再生率影响
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl 处理 感受态
热休克法
10-100L转化液涂含抗 菌素的平板
37℃摇1小时
加入1mL LB培 养基
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
平板培养基培养细菌
10-100L转化液
涂于含抗菌素的平板
37℃过夜
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转
化仪的样品池中，两极施加高压电场。 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产