发育生物学-水生所

发育生物学考试答卷

一、论述题

1、试述在受精过程中防止多精受精的两种主要机制及其观察实验的经典方法.

答：卵细胞受精过程中为阻止多精受精主要有两种机制：1、通过卵细胞的膜电位变化快速的阻止精子进入卵细胞；2、是通过皮层颗粒胞吐反应分泌颗粒内容物，使膜硬化，形成受精膜持久阻止精子进入卵中。

1、卵膜电位快速变化。

以海胆为例，海胆卵在海水中细胞外具有特别高的Na+浓度，细胞质的游离钠离子则相对较少，K+则在细胞中含量很高，细胞膜不断阻止钠离子内流以及钾离子外流，由于卵细胞膜上的离子浓度存在差异，采用微电极技术检测静止膜电位为-70mV，当第一个精子结合后1-3s钠离子内流，使膜电位开始向正值转换，此时检测膜电位变化为+20mV，由于精子可以与静息电位-70mV的融合，但不能与静息电位为+20mV的卵细胞膜融合，从而阻止多个精子入卵，阻止第二次受精。

2、海胆的皮层反应：

膜电位变化阻止多精受精仅仅只会持续1分钟，不足以完全阻止多精入卵，之后的阻断则由皮层完成。皮层由皮层颗粒组成，通常分布在没有微绒毛结构的卵质膜下方，当第一个精子与卵子发生质膜融合时，质膜融合处的卵子皮层颗粒与卵子发生质膜融合，并在该处钙离子浓度升高，胞吐作用发生，皮层颗粒破裂，颗粒物质蛋白酶、粘多糖以及过氧化氢酶、透明素等释放到卵周隙，裂解卵黄膜蛋白和细胞膜之间的连接蛋白并去除结合素受体及其结合的精子形成受精膜并使其硬化，阻止多精入卵。此时，卵黄膜改称受精膜，其它精子再也不能穿过卵黄膜。受精膜在精子进入卵开始形成，并逐渐伸展延伸至整个卵细胞周围。

2、简述DMRT1基因家族成员在哺乳、鸟类、两栖类以及鱼类性别决定和分化中的作用。并以该家族为例说明性别决定和分化相关基因的进化特点。

答：性别决定是一个可塑性的发育过程，主要分为环境性别决定以及遗传性别决定，遗传性别决定一般由性染色体中一系列性别决定基因启动一些性别相关基因，进一步诱导精卵巢形成。但是，性别决定基因在不同物种中并不稳定。Dmrt1是含DM结构域的转录因子，在进化上相对保守的因子，参与首个性别决定以及精巢分化。在哺乳动物中，由于存在性别决定基因sry，dmrt1受sry调控参与

雄性发育的级联信号通路，对性别决定以及分化也起到重要作用。在小鼠中dmrt1的缺失会导致卵巢特异性基因表达增加促使塞托利细胞向颗粒细胞转化，说明其是睾丸分化所必须基因，在哺乳动物出生后的精巢中，DMRT1阻抑了雌性的再程序化。

在鸟类中，几乎所有鸟类的性别决定系统都为ZW型，且Z染色体保守。1999年Nanda发现鸡的dmrt1基因特异性定位在Z染色体上，并在所有鸟类的Z染色体上都是保守的。进一步在鸡中分析dmrt1，确定其为依赖剂量效应的鸟类性别决定候选基因，可能是dmrt1的MHM域的甲基化程度调控性别。2010年后发现性别决定在性别激素影响之前，dmrt1则只在性腺中表达，可能在dmrt1上游还有基因调控性别，dmrt1可能受到上游基因影响其MHM的甲基化程度来调控鸟类性别。

在两栖动物中，既存在XX/XY也存在ZZ/ZW性别决定系统，大部分两栖动物的性染色体并没有明显分化。目前仅在ZZ/ZW系统中鉴定出性别决定基因DMW（dmrt1在W染色体上的拷贝），DM 域同源性高达89%，但在c端缺少dmrt1的激活中心，可能在功能上有所不同。实验证明Dmr1与DMW 存在性腺表达差异，进一步研究发现，DMW的导入会使ZZ个体出现雌性，dmrt1导入会使ZW出现精巢特征，推测二者高度相似的序列使其在性别决定早期间DMW与dmrt1存在竞争靶点，阻止dmrt1发挥作用。

鱼类是脊椎动物中性别决定方式最多的类群，多样化的性别决定使其成为理想的研究性别决定的模型。早在1921年明确青鳉为XX/XY型性别决定系统。青鳉在染色体形态上也没有分化，2002年在Y染色体上发现一个含DM域的基因与dmrt1同源性达83%。且在性别决定之前表达。通过实验证明Dmy是青鳉雄性发育所必须的，于2007年证明Dmy是青鳉的性别决定基因。研究dmy以及dmrt1发现都有一个转座子的靶点，二者可能是通过对转座子的竞争性结合从而对青鳉性别决定起作用。青鳉dmY/dmrt1Y 是常染色体dmrt1最近复制过来的，是非常新的基因。

2、性别决定和分化相关基因的进化特点：

在哺乳动物中，由于存在sry性别决定基因，Dmrt1仅仅起到睾丸发育必须，在鸟类中，dmrt 则作为性别决定候选基因存在，可能存在性别主控基因影响dmrt1。在两栖以及鱼中，dmrt1演化成一些两栖类的性别决定基因，在性别分化过程中起着至关重要的作用。由此可见，在进化上这些性别相关基因具有不稳定性、多样性、可变性、功能不保守性等特点。

3、简述鱼类细胞核移植和和细胞干细胞研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义

1、鱼类细胞核移植研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义

细胞核移植是指将一个二倍体细胞核移入另一个去核或不去核的未受精卵中，在一定条件下，像

受精卵一样分裂分化以及发育成幼体甚至成体的技术。细胞移植技术有本世纪30年代发展起来，用于研究发育过程中细胞核与细胞质功能及其二者互作关系，探索遗传发育和细胞分化等一些理论问题，后来被发现可培育出新的品种。鱼类因产卵多，卵体积大及体外受精和发育等优点，是研究细胞核移植的极好材料。

1938年德国著名科学家Spemann提出核移植设想，于1952年Briggs和King在两栖蛙类中获得成功。60年代初，我国实验胚胎学家童第周先生首先将核移植用于硬骨鱼类，研究核质发育。后来，童第周又对不同科之间的鱼类进行核移植，发现细胞质和细胞核对信息遗传的表达都有影响。杂种鱼的诞生以及饲养到性成熟，证明细胞核移植方法获得远源杂种鱼是培养具有重要经济价值的鱼类新品种的有效途径。1980～1984年, 陈宏溪等连续核移植将短期培养的鲫鱼和金鱼肾细胞的细胞核移植入鲫鱼去核卵中，结果鲫鱼之间的核移植获得了核质杂种鱼，并成功得到肾细胞的核移植的性成熟成鱼。表明经过培养的分化了的成鱼体细胞核已恢复分裂能力。1990年，张念慈等人进行青鱼和草鱼的体外属间移植实验，以经过16次传代培养的草鱼胚胎细胞为供体, 青鱼成熟未受精孵作受体, 获得发育至原肠期胚胎4个, 发育至尾芽期胚胎3个, 心跳期胚胎1个。又以经过15代培养的青鱼囊胚细胞作供体, 团头鲂未受精孵作受体, 获得发育至体节出现期胚胎6个；2001年，胡炜在斑马鱼模式动物与红鲤、泥鳅、金鱼以及稀有鮈鲫之间进行异种细胞核移植，从而讨论鱼类细胞核移植在程序化机制，他发现，连续核移植技术可以显著提高鱼类异种体细胞移植胚的发育率；卵细胞质对细胞核在程序化作用与供体细胞核所处的细胞周期密切相关，推测体细胞再程序化以及重构胚发育阻滞的机制与mtDNA与核基因间的相互作用紊乱导致DNA损伤细胞凋亡等有关。2002年，青岛海洋大学李莉将斑马鱼头肾细胞和尾鳍细胞经培养后移入同种鱼的去核卵中并获得了发育至尾芽期和肌肉感应期的胚胎。

在鱼类中展开细胞核移植的研究不仅仅是利用鱼类优势研究胚胎发育过程中细胞核和细胞质的功能，也是为了获得优良性状的核质杂种鱼。中国的水产养殖广泛，鱼类已经作为常见餐桌的食物，从中摄取的优质蛋白有益于我们人类身体健康，而具有生长优势以及高营养价值的核质杂种鱼是一个很有应用价值以及推广前景的优良鱼类，细胞核移植已经成为鱼类鱼中的重要方法。除此之外，鱼类细胞核移植技术可用于研究细胞核发育潜能，多倍体纯合、二倍体的育种等，可以利用这一技术系统来研究鱼类外源染色体对发育的影响以及探索改良品种的可能性。核移植技术在鱼类育种上发挥重大的作用。

2、细胞干细胞研究进展以及在鱼类开展以上工作的理论意义

胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期发育胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离得到的一种未分化的永久性细胞系。这种细胞一方面保留了所有的发育潜力，在适合的条件下，能够分化成多种类型的细