细胞因子的检测与应用CBA教程教案
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TNF-
10
IFN-
1
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.26 B = 5.00 C =3.60 D = 3.89 R^2 = 0.9973
细胞因子的检测与应用 暨BD CBA技术简介
苏州市跃亚生物技术有限公司 赵寅岗
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快
速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
一个细胞的全面研究
Cell Vol. 132, January 25, 2008
什么是CBA?
CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析 样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA 微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性 抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加 入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹 心复合物进行检测。
A = 1.33 B = 4.08 C =3.24 D = 4.42 R^2 = 0.9987
CBA 分析软件
Home Screen
Toolbar Calibration entry screen
BD CBA Flex Set
• 基本原理与CBA kit相似 • 检测原理不同：
Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在 流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧 光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上 的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白， PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。
FL3 (670LP)
104
IL-8
103
IL-6
102
101
100 100 101 102 103 104 Detector Ab Intensity
FL2 (585/42BP)
BDTM CBA Kits
操作步骤
检测物与捕获微球共孵育 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记） 洗涤 流式细胞仪检测 CBA分析软件批量数据分析
可检测的样本种类多样
各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组 织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
• 细胞大小 • 细胞颗粒度 • 细胞表面积 • 核浆比例 • DNA含量与细胞周
期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
Human Th1/Th2 Cytokine CBA –标准曲线
5000 pg/ml 2500 pg/ml 1250 pg/ml 625 pg/ml
IL-2
IL-4
312 pg/ml
80 pg/ml
20 pg/ml
IL-5
IL-2 IL-4 IL-5
FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL-10IFN-g
A = 1.31 B = 3.77 C =3.37 D = 4.77 R^2 = 0.9997
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
TNF-a 10000
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.29 B = 4.24 C =3.43 D = 4.33 R^2 = 0.9991
IL- 10 10000
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.34 B = 4.11 C =3.42 D = 4.45 R^2 = 0.9987
A = 1.31 B = 3.86 C =3.30 D = 4.45 R^2 = 0.9980
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL- 5
IL-10 10000
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IFN-
10
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
• 多重分析 • 节约样本 • 灵敏度高
CBA原理
Capture Ab
+
Capture Bead
+
Analyze of Interest
Fluorescent Detector Ab- PE
一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，
与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。
CBA原理 +
Bead Intensity
流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理
技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术 、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
BD Accuri C6
流式细胞术原理
流式细胞术流程
样本收集及处Leabharlann Baidu 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
流式细胞术检测样本
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TNF-
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.26 B = 5.00 C =3.60 D = 3.89 R^2 = 0.9973
细胞因子的检测与应用 暨BD CBA技术简介
苏州市跃亚生物技术有限公司 赵寅岗
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快
速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
一个细胞的全面研究
Cell Vol. 132, January 25, 2008
什么是CBA?
CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析 样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA 微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性 抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加 入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹 心复合物进行检测。
A = 1.33 B = 4.08 C =3.24 D = 4.42 R^2 = 0.9987
CBA 分析软件
Home Screen
Toolbar Calibration entry screen
BD CBA Flex Set
• 基本原理与CBA kit相似 • 检测原理不同：
Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在 流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧 光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上 的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白， PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。
FL3 (670LP)
104
IL-8
103
IL-6
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100 100 101 102 103 104 Detector Ab Intensity
FL2 (585/42BP)
BDTM CBA Kits
操作步骤
检测物与捕获微球共孵育 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记） 洗涤 流式细胞仪检测 CBA分析软件批量数据分析
可检测的样本种类多样
各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组 织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
• 细胞大小 • 细胞颗粒度 • 细胞表面积 • 核浆比例 • DNA含量与细胞周
期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
Human Th1/Th2 Cytokine CBA –标准曲线
5000 pg/ml 2500 pg/ml 1250 pg/ml 625 pg/ml
IL-2
IL-4
312 pg/ml
80 pg/ml
20 pg/ml
IL-5
IL-2 IL-4 IL-5
FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL-10IFN-g
A = 1.31 B = 3.77 C =3.37 D = 4.77 R^2 = 0.9997
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
TNF-a 10000
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.29 B = 4.24 C =3.43 D = 4.33 R^2 = 0.9991
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.34 B = 4.11 C =3.42 D = 4.45 R^2 = 0.9987
A = 1.31 B = 3.86 C =3.30 D = 4.45 R^2 = 0.9980
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL- 5
IL-10 10000
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TNF- 100
Il-4 10000
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Il-2 10000
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IFN-
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
• 多重分析 • 节约样本 • 灵敏度高
CBA原理
Capture Ab
+
Capture Bead
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Analyze of Interest
Fluorescent Detector Ab- PE
一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，
与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。
CBA原理 +
Bead Intensity
流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理
技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术 、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
BD Accuri C6
流式细胞术原理
流式细胞术流程
样本收集及处Leabharlann Baidu 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
流式细胞术检测样本