高中生物选修一：2.1微生物的培养与应用

三、 培养基
5.倒平板 培养基冷却至约50℃左右时
①左手拔 出棉塞
②灼烧灭菌
③通过缝隙 倒入培养基， 盖盖
④冷却倒置
6.无菌检查：
37℃倒置培养24～48h，观察是否有微生物生长。
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （一）平板划线法
1.操作：
②冷却接种环， 打开菌种的棉塞 ③试管口灭菌
5 4 1 2 3
可能存在的微生物污染培养物； 划线结束时灼烧接种环，及时杀死接种环上残留 的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
纯化微生物：每次划线前的灼烧，为杀死上次残留的菌种，
保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划 线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次 划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （一）平板划线法
固体平板培养基
固体斜面培养基
液体培养基
三、 培养基 （三）基本成分
成分 举例 作用或特点
适于自养生物， 不提供能量 适于异养生物， 可提供能量
碳 源
氮 源
无机物
有机物 无机物 有机物
CO2、HCO3 等
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
-
N2、NH4＋、NH3、NO3-等
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、 参与酶的组成；调节并 CaCl2、Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。 维持细胞的渗透压；调 节PH的平衡。 良好溶剂，参与物质运输；参与细胞内一系列 化学反应；酶催化的介质
三、 培养基
5.倒平板 培养基冷却至约50℃左右时
①左手拔 出棉塞
②灼烧灭菌
③通过缝隙 倒入培养基， 盖盖
④冷却倒置
问题讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用 来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物生长。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖 与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？ 答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
①接种环 灼烧灭菌
④沾取菌种
⑥通过缝隙， 划3-5平行线， ⑤试管口灭菌， 盖盖，不要划 塞棉塞 破培养基
⑦灼烧接种环， ⑧倒置培养 冷却后，从1区 末端往2区划线， 重复操作
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （一）平板划线法
2.培养方法：
三个重复平板 空白对照
1 倒置培养
2 倒置培养
3 倒置培养
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （二）稀释涂布平板法
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （二）稀释涂布平板法
1.操作 将菌液进行一系列的梯度稀释
①移液管、试管 及水等要灭菌； ②菌液与水要混 匀； ③移液管、试管口 要离火焰1～2cm处。
涂布平板（接种）
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （二）稀释涂布平板法
0 倒置培养
3.培养结果：
1
2
3
0
对照组： 无微生物生长
划线组：分离到由一个细胞繁 殖而来的菌落
3
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （一）平板划线法
问题讨论
1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种 环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
防止污染：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上
二、 无菌技术
（三）消毒
1.定义
指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一 部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）
2.方法
1）煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2）巴氏消毒法：70-75℃下煮30min 或 80℃下煮15min 3）化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消毒; 氯气消毒水源
无机盐
水 生长因子
微生物生长所必需的、微量的、自身不能合成或合成很 少的有机物。包括维生素、某些氨基酸、碱基三类物质
三、 培养基 （四）制备（牛肉膏蛋白胨固体培养基）
1.计算：依配方计算100mL培养基所需各成分的用量。 2.称量：玻璃棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。
牛肉膏和蛋白胨易吸潮，称取时动作要迅速。 牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上 的牛肉膏也溶于水中，减少误差 3.溶化： 灭菌时避免水蒸气浸湿棉 牛肉膏、称量纸 、少量水加入烧杯→加热溶解→取 塞，取出培养基时，也起 纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→冷却调 pH→琼脂 → 防止污染和挥发 到隔绝空气中杂菌的作用 搅拌熔化→补水至100mL 作为凝固剂 4. 灭菌：培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧，高压 防止琼脂糊底而 蒸汽灭菌；培养皿 导致烧杯破裂 5～8套作一包，放于干热灭菌箱内灭菌。
五、 结果分析与评价
1.培养未接种培养基的作用是什么？若有菌落形成，说明什么？
对照； 培养基灭菌不彻底。
2. 在培养基上，大肠杆菌菌落颜色？形态？
呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。
3. 培养12h和24h后的菌落大小？菌落分布位置？原因？
大小不同；菌落分布位置相同。 原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积 越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。
问题讨论
2. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3. 在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上 一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少， 每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目 随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由 单个细菌繁殖而来的菌落。
接种针、钩、环
二、 无菌技术
2)干热灭菌
干热灭菌箱内160～170℃ 1～2小时，适 用于耐高温、需保持干燥的物品（吸管、 培养皿）和金属用具等。
3)高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌锅内100KPa、121℃、 15～30min；适用于培养基、水的灭菌。
灭菌完毕后，若压力未降到零就打开气阀， 利用干热灭菌箱和高压蒸汽灭菌锅灭菌时， 高压蒸汽灭菌前，为什么要将灭菌锅内的 超 会出现什么现象？为什么？ 物品不能摆的太挤，为什么？ 冷空气排尽？ 净 工 利于温度升高。若冷空气未排尽，当压力升 灭菌容器内的液体冲出容器。因为灭菌锅内 作 时，锅内温度不会上升到应有高度， 到100kpa 以免妨碍热空气或蒸汽的流通 外压力不平衡的缘故 台 导致灭菌不彻底
2.培养方法： 各梯度分别涂布3个平板，1个不涂布作空白对照。
3.培养结果： 稀释度足够的菌液在培养基表面形成单个菌落
四、 纯化大肠杆菌（微生物的接种） （二）稀释涂布平板法
问题讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系 列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培 养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸 管要在酒精灯火焰周围等等。
1. 球菌
肺炎双球菌 金黄色葡萄球菌 乳酸链球菌
2. 杆菌
大肠杆菌 苏云金芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌
3. 螺旋菌
霍乱弧菌 幽门螺旋菌 齿垢密螺旋体
（四）细菌的芽孢和孢子
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆
形的休眠体（不是生殖细胞）。 芽孢的壁很厚，含水量极低，抗逆性极强（对干旱、低 温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力）。 环境适宜时，芽孢可以萌发，形成一个细菌。
4）紫外线消毒：只适用于表面灭菌和空气灭菌
5）化学药物消毒:照射前喷洒式碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，以增强消毒效果
二、 无菌技术
（四）灭菌
1.定义
使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢 和孢子。
2.方法
1)灼烧灭菌
在酒精灯火焰上灼烧。适用于接种环、接种 针、接种钩等金属用具以及试管口、三角瓶 口灭菌
一、 微生物
（一）特点
①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小； ⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。
（二）类型
原核: 细菌、放线菌、支原体、蓝藻等 显微藻类：衣藻、小球藻等 原生 生物 原生动物：草履虫、变形虫等
微 生 物
真核
真菌： 酵母菌、霉菌等
非细胞类： 病毒、类病毒、朊病毒等
（三）细菌的形态
三、 培养基 （一）定义
营养物质 的不同需求，配制出供其 人们按照微生物对__________ 生长繁殖 的营养基质叫培养基
（二）类型（按物理性质划分）
种类 是否含凝固剂
琼脂
用途
固体培养基
半固体培养基 液体培养基
1.5%-2.5%
0.2%-0.7% 否
分离、计数、鉴定
观察运动、鉴定菌种 工业生产
固体培养基：菌落
孢子：细菌的生殖细胞
细菌芽孢的结构模式图
（五）菌落
菌落：由单个细菌（或其他微生物）细胞或少数同种细
胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形 成肉眼可见的子细胞群体。 菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等基本特征。 菌落是鉴定菌种的重要依据。
（六）病毒的繁殖
吸附
注入
合成
源自文库
释放
组装
噬菌斑即噬菌体侵染细菌细胞，导 致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养 基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑 （“负菌落”）。 在适当条件下，一个噬菌体形成一 个噬菌斑。
4.在某培养基上出现了不同形态的菌落，是什么原因？
培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。
六、 菌种保藏 （一）临时保藏
接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃
冰箱保存。
扩大接种面积
（二）长期保藏
固体斜面培养基
甘油冷冻管藏法：甘油灭菌后与菌液混匀，-20℃ 冰箱保存。
二、 无菌技术
（一）定义
在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
（二）措施
1. 对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 空气中有大量的微生物， 而酒精灯的火焰旁能形成 2. 将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 一个无菌区域。 3. 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火 焰附近进行。 4. 实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品 相接触。