重亚硫酸盐测序技术介绍
Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
重亚硫酸盐测序技术介绍PPT课件
未来重亚硫酸盐测序技术将进一步优化测序精度，降低测序错误率， 提高数据分析的可靠性。
测序成本不断降低
随着技术的成熟和规模化生产，重亚硫酸盐测序技术的成本将逐渐 降低，使得更多人能够享受到基因测序的益处。
在生物医药领域的应用前景
疾病诊断与预测
重亚硫酸盐测序技术可用于检测与特定疾病相关的基因变 异，从而为疾病的早期诊断和预测提供依据。
其他应用领域
进化生物学研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以对不同物种的基因组 进行比较分析，研究物种进化关系和演化历程。
药物研发
通过重亚硫酸盐测序技术，可以对药物作用靶点进行 精准定位，为新药研发提供有力支持。
生物多样性研究
利用重亚硫酸盐测序技术，可以研究生物多样性，包 括物种分类、种群结构等。
03
比较与选择
重亚硫酸盐测序技术
在DNA序列分析中，重亚硫酸盐测序技术是一种基于连接反应和重亚硫酸盐转化的序列 特异性扩增技术。它具有高灵敏度、高特异性和可检测突变丰度的优点，因此在基因突变 筛查、基因分型和突变体鉴定等领域具有广泛的应用价值。
与其他测序技术的比较
与第二代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的通量更高，能够检测低丰度的突变；与第 三代测序技术相比，重亚硫酸盐测序技术的准确性更高，适用于对准确性要求较高的应用 。
代表性技术
基于PCR扩增和光学检测的Sanger测序法。
特点
准确性高，但通量低，测序长度短，主要用于完成人类基因组计划等基础研究。
第三代测序技术
代表性技术
基于纳米孔的单分子测序技术（如PacBio RS II）和合成式测序技术（如Illumina MiSeq）。
特点
高通量、长读长，但准确性相对较低，主要用于临床诊断、基因组组装和基因表达分析 等应用。
Illumina_HiSeq_2000-BGI
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
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HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
进行表观基因组学实验的三个步骤
进行表观基因组学实验的三个步骤2008年早期，美国国家卫生研究院NIH宣布了一项涉及1.9亿元，时间长达5年的表观遗传学项目，这一项目作为NIH“路线图计划”（RoadMap Initiative）的组成部分，总体目标包括几个方面，比如绘制正常人类细胞和组织表观遗传系列参考图谱，研发新型研究工具等。
今天这些努力开始初见成效，NIH共同基金与一些私人研究机构已经资助了68项表观遗传学项目，获得了52份表观遗传图谱（不同细胞类型DNA甲基化和组蛋白修饰图谱），在去年9月，相关研究人员发表了30篇论文，介绍了这些研究成果，也解析了相关的转录因子结合位点，染色质高级结构，转录区域，以及将近150个细胞系中的更多人类基因组以外的信息。
而且更重要的是，通过这些研究，我们获得了大量新型表观遗传学和表观基因组学的分析技术，令我们更清楚的了解了基因组水平上细胞内发生的事件。
正如NIH共同基金办公室主任James Anderson 所说的那样，这些才是花费上百万美元的真正收获。
由此Science杂志特以“Epigenomics: The New Technologies of Chromatin Analysis”为题，总结概况了这些技术，文章分为甲基化分析，组蛋白分析，以及分离分选技术。
紧抓“甲基化”获得表观遗传学项目Epigenomics Program资助的一位研究人员，是来自加州大学圣地亚哥分校路德维希癌症研究所的华人科学家任兵（Bing Ren，音译），作为这一项目四大关键表观遗传学图谱研究中心之一的研究院首席研究员PI，任兵的研究方向为胚胎干细胞表观遗传学。
自2008年以来，圣地亚哥表观遗传学中心已经资助了1570万美元，用于绘制人类胚胎干细胞和四种干细胞分化细胞类型的DNA甲基化图谱，以及20个组蛋白修饰的图谱。
任兵表示，表观遗传学项目的重要性“与人类基因组测序技术的重要性相当”，“有了人类基因组图谱，就有了了解人类发育的蓝图，但是如果没有一个详细的表观遗传学解析图谱，我们就无法解读这个蓝图。
重亚硫酸盐测序技术介绍
DNA甲基化含义 DNA甲基化含义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5 mC） DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7 mG） 呤（7-mG）
启动子的CpG岛 启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 起始” 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程介绍WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图分析结果示例图片展示示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]示例图来源文献[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
DNA重亚硫酸盐转化
> 85% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
> 85% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
图 1 重亚硫酸盐处理后胞嘧啶（cytosine）转化为尿嘧啶（uracil）
图 2 重亚硫酸盐处理将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U） ，5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持不变； 再经 PCR 扩增，U 转换为胸腺嘧啶（T） ，而 5-mC 重新恢复为 C，以此可将基因中的 C 与 5-mC 区别开。
产品名称
货号 研发代码 用途
DNA 产品关键词 Illumina 工 作流程兼容 最稳定可靠 重亚硫酸盐 测序、 NGS 和 各种 MSP 的 理想选择 DNA 50 pg < 2 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工 作流程兼容 热循环变性 液体重亚硫 酸盐转化试 剂 DNA 100 pg 1 hour 8-20 μl 99.9% √ 反应快速 real-time MSP 的理想 选择 测序最佳选 择 DNA 200 pg 30 minutes 10-20 μl 99.9% √ 省 略 了 DNA 分 离 的步骤 DNA 含量 低样品的理 想选择 细胞、 组织、 血液 100 个细胞， 1 μl 血液 < 3 hours 8-20 μl 99.9% √ Illumina 工作 流程兼容 流线型高通 量分析 专为大量样 品或者自动转 化设计 DNA < 10 ng < 1 hour 20 minutes 20 μl 99.9% √
起始材料 最低 DNA 用 量 转化所需总 时间 洗脱体积 转化效率 脱磺酸基作 用/清除 回收率 转化后 DNA 片段尺寸 储存管
> 75% 平 均 ： 200-2000 bp 峰值 800 bp 离心管
《重亚硫酸盐测序技术介绍》PPT课件
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。
缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序 的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参 与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。
研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基 因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一， 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的 又一个机制。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲 基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基 化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点 外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段 若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲 基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不 论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏 感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶 切完全，否 则会出现假阳性。
甲基化测序
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。
检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。
重测序技术方案
重测序技术方案引言重测序技术是一项用于测序DNA或RNA的技术，可以帮助我们了解生物体内的基因组结构和功能。
随着测序技术的不断发展和进步，重测序技术也在不断创新和完善。
本文将介绍几种常见的重测序技术方案，并比较它们的特点和应用。
Sanger测序技术Sanger测序技术是第一代测序技术，也被称为链终止法。
它基于DNA合成过程中的链终止原理，使用一组标记有荧光的缺失氧核苷酸，并与待测DNA模板进行扩增反应。
在扩增反应中，不同长度的引物扩展产生的片段会被分离并测量其荧光信号，从而确定DNA序列。
Sanger测序技术具有高准确性和可靠性，能够读取数百个核苷酸，但其缺点是低通量和高成本。
由于需要单个片段的扩增和测序，Sanger测序技术适合对小规模的基因片段进行测序。
Illumina测序技术Illumina测序技术是一种广泛应用的高通量测序技术，也被称为第二代测序技术。
它基于桥式扩增（bridge amplification）和荧光染料标记的可逆终止原理，通过在DNA复制过程中加入终止核苷酸和复合酶的方法进行测序。
Illumina测序技术具有高通量、低成本和高可靠性的特点。
其通过并行测序技术，能够同时读取上百万个DNA片段，从而大大提高了测序速度和效率。
然而，Illumina测序技术对于长序列的读取存在一定的挑战，需要通过后续的重组技术来获得完整的DNA序列信息。
PacBio测序技术PacBio测序技术是一种第三代测序技术，也被称为单分子实时测序技术。
它基于聚合酶链反应（PCR）和DNA聚合酶的原理，通过监测DNA合成过程中的荧光信号来实现测序。
PacBio测序技术的主要优点是能够实现长读取长度和高准确性。
由于其对DNA片段长度没有限制，因此适用于测序整个基因组或长片段DNA。
另外，PacBio测序技术还能够实时监测DNA合成过程，提高了测序准确性。
然而，PacBio测序技术的缺点是测序速度较慢，并且存在一定的错误率。
重亚硫酸盐测序操作方案
重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。
2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。
迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。
最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。
二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。
4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。
9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。
10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。
三、甲基化基因的PCR第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。
第二轮反应体系扩大为50 μL。
快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。
四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g=100 μL）QG Buffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450 μL，以便于离心。
16、加入1倍胶体积（150 μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g，1 min。
(完整版)亚硫酸氢钠测序法
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.第一部分基因组DNA的提取.这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3： 42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.8：50℃避光水浴16h.一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.这一步细节：1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收. 4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.第三部分修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min. 7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.10：-20℃保存DNA溶液.此步细节：1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用. 2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.第四部分修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递. 这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.第五部分 PCR产物的凝胶回收这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.几个细节：1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）15ul体系T-easy 1ulLigase 1ul2xbuffer 7.5ulDNA 5.5ul4度,过夜.2：连接产物的转化1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；3）42度, 90秒钟；4）冰上2分钟；5）800ul LB培养基；6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.3：取白斑,划种于新板上新板：先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.针头挑白斑划2道于板上相应区域内.37度,孵箱过夜.4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.这一部分的细节：1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.。
(完整版)亚硫酸氢钠测序法
亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing)直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.第一部分基因组DNA的提取.这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3： 42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.8：50℃避光水浴16h.一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.这一步细节：1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收. 4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.第三部分修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min. 7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.10：-20℃保存DNA溶液.此步细节：1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用. 2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.第四部分修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递. 这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.第五部分 PCR产物的凝胶回收这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.几个细节：1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）15ul体系T-easy 1ulLigase 1ul2xbuffer 7.5ulDNA 5.5ul4度,过夜.2：连接产物的转化1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；3）42度, 90秒钟；4）冰上2分钟；5）800ul LB培养基；6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.3：取白斑,划种于新板上新板：先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.针头挑白斑划2道于板上相应区域内.37度,孵箱过夜.4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.这一部分的细节：1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.。
全基因组甲基化测序(WGBS)
全基因组甲基化测序（WGBS）
技术简介：
全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法，首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理，将未甲基化的C碱基转化为U碱基，而甲基化的C碱基则不会改变，进行PCR扩增后U碱基会变成T，与原本甲基化的C碱基区分开，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
应用领域：
•基因表达调控
•发育表观组学
•细胞分化、组织发育
技术优势：
•可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
•可在全基因组水平上最大限度的获取完整的甲基化信息，精确绘制全基因组甲基化图谱
•适用于所有具有参考基因组的物种
•性价比高，相对于传统BSP或MSP方法，费用少
实验流程
A.建库测序流程
B.数据分析流程
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。
全基因组重亚硫酸盐测序【最新版】
全基因组重亚硫酸盐测序表观遗传学研究已经证实了特定基因区域的DNA甲基化修饰对于染色体构象、基因表达调控机制有着重要影响，而全基因组DNA甲基化研究将是表观基因组学最为关注的内容之一。
Bisulfite处理能够将基因组中未发生甲基化的C 碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析，必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义，并且为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。
技术优势:■单碱基精确度:精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
■里程碑式的研究:特定物种的表观基因组学研究的重要内容，适用于所有具有精确基因组图谱的物种。
实验流程:● 基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段● DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。
● 采用EZ DNA Methylattion-Gold kit 进行Bisulfite 处理● 脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。
● 合格的文库用于上机测序。
信息分析流程图:生物信息分析:1. Data Clean测序结果进行去污染，去接头处理。
根据测序产生的序列文件*.fq 统计read长度，read 数量，数据产量。
2. 标准信息分析2.1 Bisulfite-seeq 序列与参考序列的比对在信息分析过程中，首先将每一对reads中正链reads上的C碱基转换为T碱基，而反链reads中的G碱基转换为A 碱基。
在此基础上使用SOAP软件，将reads与参考基因组序列进行比对，唯一比对reads将用于甲基化信息的分析。
数据比对统计结果如下:2.2 C碱基测序深度的累积分布甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式(CG, CHG和CHH，其中H代表A 或T 或C碱基)。
下述图表中反映了三种不同分布类型的C碱基的测序深度累积分布。
进行表观基因组学实验的三个步骤[整理]
![进行表观基因组学实验的三个步骤[整理]](https://img.taocdn.com/s3/m/69b31e77dcccda38376baf1ffc4ffe473368fdf6.png)
进行表观基因组学实验的三个步骤02008年早期，美国国家卫生研究院NIH宣布了一项涉及1.9亿元，时间长达5年的表观遗传学项目，这一项目作为NIH“路线图计划”（RoadMap Initiative）的组成部分，总体目标包括几个方面，比如绘制正常人类细胞和组织表观遗传系列参考图谱，研发新型研究工具等。
0今天这些努力开始初见成效，NIH共同基金与一些私人研究机构已经资助了68项表观遗传学项目，获得了52份表观遗传图谱（不同细胞类型DNA甲基化和组蛋白修饰图谱），在去年9月，相关研究人员发表了30篇论文，介绍了这些研究成果，也解析了相关的转录因子结合位点，染色质高级结构，转录区域，以及将近150个细胞系中的更多人类基因组以外的信息。
00而且更重要的是，通过这些研究，我们获得了大量新型表观遗传学和表观基因组学的分析技术，令我们更清楚的了解了基因组水平上细胞内发生的事件。
正如NIH共同基金办公室主任James Anderson 所说的那样，这些才是花费上百万美元的真正收获。
00由此Science杂志特以“Epigenomics: The New Technologies of Chromatin Analysis”为题，总结概况了这些技术，文章分为甲基化分析，组蛋白分析，以及分离分选技术。
00紧抓“甲基化”0获得表观遗传学项目Epigenomics Program资助的一位研究人员，是来自加州大学圣地亚哥分校路德维希癌症研究所的华人科学家任兵（Bing Ren，音译），作为这一项目四大关键表观遗传学图谱研究中心之一的研究院首席研究员PI，任兵的研究方向为胚胎干细胞表观遗传学。
自2008年以来，圣地亚哥表观遗传学中心已经资助了1570万美元，用于绘制人类胚胎干细胞和四种干细胞分化细胞类型的DNA甲基化图谱，以及20个组蛋白修饰的图谱。
0任兵表示，表观遗传学项目的重要性“与人类基因组测序技术的重要性相当”，“有了人类基因组图谱，就有了了解人类发育的蓝图，但是如果没有一个详细的表观遗传学解析图谱，我们就无法解读这个蓝图。
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重亚硫酸直接测序法对启动子测序 的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参 与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。 研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基 因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一， 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的 又一个机制。
谢谢！
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲 基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基 化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点 外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段 若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲 基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不 论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏 感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶 切完全，否 则会出现假阳性。
SSCP
将亚硫酸氢盐处理和单链构 象多态性 PCR(PCR．SSCP)结合起来，设计了针 对 转化后DNA序列的引物，同时扩增 未甲基化和甲 基化的DNA，由此产生 的两种不同的扩增产物可以 通过SSCP 区分。此方法可方便地应用于任何序 列的甲基化状态的分析，能对甲基化 的等位基因进行半定量，获得甲基化 和未甲基化等位基因的比例；并且可 以提示甲基化状态的不均匀性。
启动子的CpG岛
CpG岛主要位于基因的启动子和第一 外显子区域，约有60%以上基因的启动 子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度 超过200bp。在启动子（promotor）或 “起始”区域周围，甲基化经常被抑 制。这些区域包含浓度相对较高的 CpG对，与此段区域对应的染色体区 段一起被称作CpG岛。CpG岛与56%的 基因编码有关。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
联合亚硫酸氢盐限制分析(combined bisul— rite restriction analysis，C0BRA) 亚硫酸氢钠可以使 DNA未甲基化的C经脱氨基作用转化为u，通过随 后的PcR，u将转化为T，但亚硫酸氢钠对已发生 甲基化的C无上述转化作用。故此，DNA经亚硫 酸氢钠处理后，进行限制性酶切CpG位点时，限 制性位点的保留与否能反应该DNA片段是否发生 甲基化。经电泳后电泳条带长度和强度差异观察， 可以分析DNA甲基化状态和甲基化程度。COBRA 集使用方便，定量准确和与石蜡切片良好的兼容 性三 种特色于一身，能定量检测微量DNA样品特 定基 因位点的甲基化状态，但由于涉及PCR和限 制性酶 的使用，通常只能分析一个特定的序列
重在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷 酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞 嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。大多数脊椎 动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要 集中在基因5＇端的非编码区，并成簇存在。甲基 化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后， 甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基 化。DNA的甲基化可引起基因的失活。 DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC） 和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌 呤（7-mG）
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。 缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的
house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身 就会存在于DNA中，因此不易被 修复，所以被淘汰。故CpG在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。