胚胎冷冻技术 ppt课件
合集下载
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存技术摘要; 胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。
关键词：胚胎冷冻保存为便于长途运输和随时供移植使用，将那些６～７日龄已有２０～３０个细胞的新鲜活胚胎（或分割后的半胚胎、１／４胎）在－１９６℃的超低温下冷冻贮存就是胚胎冷冻保存技术。
这是在冷冻精子的技术基础上进一步发展起来的一项新技术。
目前用冷冻胚胎移植的成功率约为鲜胚胎的７０％～８０％，胚胎冷冻保存技术可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率的目的。
现有的胚胎冷冻保存方法有四种：一、常规冷冻法常规冷冻法：也叫慢速冷冻法、逐步降温法。
将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度1．4M)，每种冷冻液中平衡5分钟，然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行冷冻。
冷冻速率先以1～3~C／分下降至-6～-7℃，在此温度诱发结晶，平衡10分钟，然后，以0．3℃／分的速率降温至-35～_38℃，之后投入液氮中保存。
胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20％血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。
或者将解冻后的胚胎放入0．5M(或1．0M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。
二、一步冷冻法一步冷冻法：也叫一步细管法。
该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。
三、程序冷冻法程序冷冻法主要采用低浓度冻结保存剂梯度脱水,经程序冷冻仪缓慢降温。
主要操作步骤包括:将细胞顺序放入一系列逐渐增加保存剂浓度的溶液中梯度脱水,置入程序冷冻仪快速降温至-6℃植冰(人工诱导冰晶形成),然后程序冷冻仪缓慢降温至-30℃~-80℃后液氮贮存。
胚胎冷冻原理
胚胎冷冻原理当科技进步到一定程度时，胚胎冷冻技术便应运而生。
胚胎冷冻是指将受精卵或初期胚胎置于低温环境下，储存起来，以便未来使用。
这项技术不仅帮助那些在生育时遭遇不孕不育的夫妇，更为科学界的发现提供了便捷的途径。
胚胎冷冻的整个过程可以分为以下几个步骤：第一步，收集和准备健康的卵子和精子。
在体外受精的过程中，取出卵子和精子，然后将它们培养在培养皿中，以促进受精卵的发育。
第二步，收集和冷冻受精卵。
将受精卵贴在培养皿上，按照标准程序进行操作。
在发育的早期，胚胎会被收集并放置在低温的液氮中，这会停止胚胎的发育，使其进入休眠状态。
第三步，储存和保护。
使用液氮条码系统来确保胚胎的标识和储存信息，以避免混淆和损失。
胚胎在常规下是能够存储5年，但在特定情况下或新技术和研究的发现，其保存时间或可延长。
胚胎冷冻可以帮助那些需要辅助生殖技术的夫妇。
例如，一些女性因年龄或疾病等原因而不能自然怀孕，或许可以将他们的受精卵冷冻下来，以备不时之需。
此外，对于那些必须接受放疗或化疗的患者，他们还可将备用胚胎存储在里面，用于将来他们生育孩子的可能性。
同时，胚胎冷冻也为科学研究提供了全新的方向。
有些科学研究无法在体外进行，因为某些特定的细胞只在某些发育阶段生存。
通过冷冻胚胎，科学家就可以拥有这些细胞并在适当的时间点解冻以进行研究。
然而，胚胎冷冻技术也存在一些争议，其中最主要的是胚胎的生命可形成。
有些人认为，在冷冻过程中，胚胎会被暴露在液氮所引发的极寒温度下，这可能导致损伤甚至死亡。
因此，他们反对这种技术并呼吁立即禁止它。
总之，虽然存在着一些争议，但胚胎冷冻技术仍是一项非常重要的科学技术。
它为那些需要帮助实现生育的夫妇提供了新的选择，并为科学研究提供了独特的途径。
我们需要继续关注这项技术的发展和应用，并逐步完善它。
胚胎冷冻技术 ppt课件
ppt课件
7
2、一步冷冻法
利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前 脱水,从而减少冷冻过程中细胞内冰晶 的形成。其特点是胚胎在室温脱水后 不需要特殊的降温程序,能在很短得时 间内完成冷冻过程,具有重要的实用价 值。
ppt课件
8
3、玻璃化法(vitrification)
Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷 冻胚胎的方法,即可用几种保护剂混合组 成一种玻璃化(vitrificationsolution,VS), 它在低温时变的很粘稠,不发生结晶就可 固化,形成不规则结构的玻璃样固体,能 保持液态时正常的分子和离子分布,因而 用玻璃化液进行胚胎冷冻前处理有较好 的保护效果。
胚胎冷冻技术
ppt课件
1
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。 • 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
原理
• 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过 慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第56天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静 止下来并可在-196度的液氮中保存的 一种方法。
ppt课件
4
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。 • 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。 • 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
《胚胎冷冻保存》课件
准化和规范化。
THANKS
02
胚胎冷冻保存技术
胚胎冷冻保存的方法
玻璃化冷冻
快速降温使胚胎进入玻璃化状态，减少冰晶形成。
程序化冷冻
慢速降温使胚胎逐渐结晶，适用于大多数胚胎类型。
显微操作
对胚胎进行显微操作，如显微切割或显微注射，以提高冷冻存活率。
冷冻保护剂的选择与使用
01
02
03
低温保护剂
选择适当的低温保护剂， 如二甲基亚砜（DMSO） 或乙二醇（EG），以保护 胚胎免受低温损伤。
技术挑战
04
胚胎冷冻保存过程中可能存在细胞损伤的风险 ，需要不断优化冷冻和解冻技术，提高胚胎存
活率。
胚胎科研中的冷冻保存
技术简介
胚胎科研中的冷冻保存 主要用于研究胚胎发育 的机制和过程，通过低 温生物学方法将胚胎在 液氮中长时间保存。
应用场景
主要应用于动物模型和 人类胚胎科研，为科研 人员提供实验材料和研
温度控制
严格控制冷冻和解冻过程 中的温度，以最大程度地 减少对胚胎的损伤。
冷冻保存的效果评估
存活率
遗传稳定性
解冻后评估胚胎的存活率，以确定冷 冻效果。
通过遗传学方法检测解冻后的胚胎是 否保持了正常的遗传物质。
发育能力
观察解冻后的胚胎是否能正常发育， 以评估其发育潜力。
03
胚胎冷冻保存的应用
辅助生殖技术中的胚胎冷冻保存
引入自动化和智能化技术，提高胚胎冷冻保存的效率和安全性。
胚胎冷冻保存技术的潜在应用领域
辅助生殖技术
为不孕不育夫妇提供冷冻保存胚 胎的服务，实现生育愿望。
动物繁殖
保护珍稀动物和濒危物种，通过 冷冻保存其胚胎实现种质资源的
冷冻胚胎的技巧
冷冻胚胎的技巧
冷冻胚胎是一种存储剩余胚胎的方法，这些胚胎可以在未来用于试管婴儿技术。
以下是冷冻胚胎的技巧：
1. 预处理：在胚胎冷冻之前，需要对它们进行预处理。
这包括将胚胎嵌入到特定的培养基中，并确保其营养充足，同时去除有害的物质和残留的细胞。
2. 冷却速度：冷冻胚胎时，必须控制冷却速度和过程，以确保胚胎没有损伤。
一般来说，冷却速度较快（2-5/min），直到达到所需的温度为止。
3. 冷冻介质：冷冻介质（例如DMSO）的选择也很关键。
介质中的一些成分会保持胚胎的完整性，并在未来的解冻过程中保护它们。
4. 存储温度：存储胚胎的温度也非常重要。
在-196的液氮箱中存储胚胎可以保证它们的长期稳定性，并且在适当时候进行解冻。
综上所述，冷冻胚胎是一项复杂的技术，需要精细的控制和专业的操作，以确保冷冻的胚胎保持完整性和稳定性。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、丙二醇等。这 些物质可以渗透到细胞内，降低细胞内的冰点，从而减少冰晶的形成。
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
THANKS
感谢观看
温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
THANKS
感谢观看
温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
《护理胚胎》ppt课件
THANKS
谢谢您的观看
• 详细描述：目前胚胎护理技术存在一定的安全性和有效性问题，如胚胎发育异 常、着床不稳定等。因此，需要深入研究胚胎发育过程中的分子机制和环境因 素，寻找关键节点，提高技术的安全性和有效性。
• 详细描述：加强胚胎护理技术的安全性与有效性研究，对于提高试管婴儿等辅 助生殖技术的成功率具有重要意义，同时也有助于预防和减少出生缺陷的发生 。
胚胎冷冻是指将早期胚胎保存在低温条件下，以便在未来需要
时进行复苏和移植。
胚胎冷冻的方法
02
主要采用玻璃化冷冻技术，通过快速降温使胚胎在低温下保持
活性。
胚胎冷冻的效果
03
经过冷冻保存的胚胎可以延长生育周期，同时提高女性生育成
功率。
胚胎解冻技术
胚胎解冻的基本概念
是指将冷冻保存的胚胎进行复苏，以备进行移植。
胚胎解冻的流程
包括将冷冻保存的胚胎缓慢升温至正常体温，并进行实验室观察 评估其活性。
胚胎解冻的效果
经过解冻复苏的胚胎能够保持正常的发育能力，成功实现妊娠。
胚胎护理过程中的注意事项
01
02
03
保持清洁卫生
在胚胎护理过程中，必须 保持实验室和操作工具的 清洁卫生，防止感染。
遵循操作规范
进行胚胎护理时，必须遵 循严格的操作规范和安全 标准，避免对胚胎造成损 害。
伦理和法律问题
胚胎护理技术的使用涉及到伦理和法律问题，如胚胎的法律地位、胚胎移植后的 父母权、代孕等问题，需要制定完善的法规和伦理规范来规范该领域的发展。
04
未来展望与研究方向
提高胚胎护理技术的安全性与有效性
• 总结词：提高胚胎护理技术的安全性与有效性是未来研究的重要方向，需要加 强研究力度，不断完善技术手段，确保胚胎的健康发育和安全着床。
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精 子为单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二 极体的排出，新陈代谢逐步加强）。 胚胎孕育着新的生命（娇嫩）。
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
胚胎冷冻保存ppt课件
冷冻保护液常用pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS） 来配制，也可用生理盐水或M199来配制。 现有保存方法有3种：程序冷冻法：一步冷冻法和 玻璃化冷冻化。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保 护剂；快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冷冻保 护剂，如甘油、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二 醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。
非渗透型冷冻保护剂 属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质， 能够溶解于水，但不能进入细胞。 机理：非渗透型冷冻保护剂主要通过该改变 渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作 用。 常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。
冷冻方法
将胚胎在含20%小妞血清的PBS溶液中清洗两次 将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油 和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10min 将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS 溶液中，立即转入胚胎冷冻细管 将细管在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存 解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速 投入20℃温水中，摇动细胞管使其解冻均匀 将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的 PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小 牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植
抗冻保护剂 胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚 胎的损伤。对于胚胎的冷冻和解冻，一50~15℃是一个致死温度区。在这个温度区细胞 容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免 冰晶的形成。 分类：渗透型冷冻保护剂 非渗透性冷冻保护剂来自渗透型冷冻保护剂
属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0℃ 以上很容易通过细胞膜进入细胞质。 机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞 内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂 与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度 从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。 常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜 （DMSO）、丙二醇和乙二醇等。
人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)版解读PPT课件
利用时间-lapse技术等， 对卵母细胞和胚胎的发育 过程进行动态监测。
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
遗传学检测
运用PGD/PGS等技术，对 卵母细胞和胚胎进行遗传 学检测，确保其遗传物质 正常。
冷冻存储条件保障
冷冻保护剂选择
选用合适的冷冻保护剂，以减少冰晶形成和细胞损伤 。
冷冻速率控制
精确控制冷冻速率，确保卵母细胞和胚胎在冷冻过程 中不受损伤。
医保和商业保险覆
盖
推动医保和商业保险覆盖玻璃化 冷冻技术，降低患者立行业合作机制
加强医疗机构、科研机构、企业等之间的合作，实现资源共享、优 势互补，推动玻璃化冷冻技术的发展和应用。
搭建学术交流平台
举办学术会议、研讨会等活动，促进学术交流与合作，提高行业整 体水平。
在不适宜的环境中。
03
胚胎玻璃化冷冻方法及操作规 范
胚胎来源与选择标准
胚胎来源
包括体外受精-胚胎移植（IVF-ET）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）后获得的胚 胎。
选择标准
选择发育良好、形态正常的胚胎进行冷冻，通常选择D3天的卵裂期胚胎或D5/6 天的囊胚。
玻璃化冷冻液成分及配置方法
成分
包括基础培养基、冷冻保护剂（如二 甲基亚砜、乙二醇等）和特定比例的 血清或人血清白蛋白。
冷冻操作流程及注意事项
预处理
将卵母细胞在冷冻保护剂中进 行预处理，以降低冰晶形成的
风险。
装载与冷冻
将预处理后的卵母细胞装载至 冷冻载体，并快速投入液氮中 进行玻璃化冷冻。
解冻与复苏
将冷冻后的卵母细胞取出，迅 速进行解冻并移入复苏液中， 以恢复其正常生理状态。
注意事项
操作过程中需保持无菌，避免 卵母细胞受到机械损伤或暴露
生育力保存项目中应用
胚胎冷冻保存技术共29页
Thank you
Hale Waihona Puke 33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
胚胎冷冻保存技术
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
Hale Waihona Puke 33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
胚胎冷冻保存技术
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
特殊设备,避免细胞内外冰晶形成,更重 要的是其粘滞性高,在6℃冷存后形成的 玻璃样结构,保持了分子、离子正常的扩 散与分配,细胞内物冰晶形成,维持了正 常的细胞超微结构,减少了对透明带和基 因的损害,提高了冷冻存活率和妊娠率。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。
• 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
2、一步冷冻法
利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前 脱水,从而减少冷冻过程中细胞内冰晶 的形成。其特点是胚胎在室温脱水后 不需要特殊的降温程序,能在很短得时 间内完成冷冻过程,具有重要的实用价 值。
3、玻璃化法(vitrification)
Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷 冻胚胎的方法,即可用几种保护剂混合组 成一种玻璃化(vitrificationsolution,VS), 它在低温时变的很粘稠,不发生结晶就可 固化,形成不规则结构的玻璃样固体,能 保持液态时正常的分子和离子分布,因而 用玻璃化液进行胚胎冷冻前处理有较好 的保护效果。
从冷冻技术第一次成功应用于人类胚
胎并获妊娠至今,有关技术、方法不断成熟。 据报道,正常胚胎移植的妊娠失败率可达到 40%～60%,冷冻胚胎尤其是冷冻IVF人胚胎 成功率就更低,一些研究结果认为,8～16细 胞的人胚胎冷冻效果较好,也有认为,4细胞 期胚胎冷冻后的成活率也不低。
从总体上讲,冻胚移植的妊娠率比 鲜胚低,影响人类胚胎冷冻保存结果的 因素是多方面的,主要有胚胎的质量(大 小、渗透性等)和分裂(发育)阶段、母 体年龄及移植时机以及冷冻保护剂(渗 透性、毒性等)和冷冻溶解程序等几方 面。
玻璃化冷冻方法简单、快速,防止了冰 晶对胚胎造成的损伤,但由于玻璃化溶液的 浓度极高且溶质存在毒性,会使胚胎的成活 率降低,所以当今研究热点集中在如何减少 高浓度溶液对胚胎的毒害作用。
另细胞是否
发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胞质部分脱水后的玻璃化和胞外溶液
的部分玻璃化是有效冷冻保存胚胎的重
要因素。胚胎在这种玻璃样固体中脱水 到一定程度,可引起内源性胞质大分子 (如蛋白质) 及已渗入白细胞内的冷冻保 护剂浓缩,从而使细胞在降温过程中得到 保护。
• 玻璃化冷冻具有许多冷存液没有的优
点操作简单、快捷、价格便宜、不需要
优势
• 可以合理限制移植胚胎数，降低多胎妊娠 率。
• 为胚胎移植失败或流产患者提供再次移植 机会,不必反复进行女性超促排卵。
• 在超排卵周期出现卵巢过度刺激综合征迹 象时，取消胚胎移植，将胚胎进行冷冻保 存，在其后非刺激周期进行冷冻胚胎移植。
方法
1、常规缓慢冷冻
此方法需专用的冷冻仪,可获得较高的 移植妊娠率,是目前生产中广泛采用并 且最为成功的冷冻方法。冷冻液一般 为1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的 PBS)。
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。
2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。
北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。
• 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。
• 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
• 超速玻璃化冷冻
是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、 Cryotop和电镜铜珊(EMG)等,通过极度 缩小含胚胎玻璃化溶液的体积来实现 “即时玻璃化”,使降温速率由普通玻 璃化的2000℃/min提高到20000℃/min 以上,有效避免了细胞内冰晶形成,并 减轻了寒冷损伤,提高了冷冻效率。
• 1985年Rau和Fahy用高浓度的DMSO、乙 酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成玻璃化 溶液，对8细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷 冻实验，获得87.5%的冻后发育率。此后。 牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后应 用玻璃化冷冻法获得成功。目前该技术已 广泛应用于畜牧生产。
原理
• 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过 慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第56天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静 止下来并可在-196度的液氮中保存的 一种方法。
与传统玻璃化冷冻方法比较
超速玻璃化冷冻一方面提高了降温速率,另 一方而缩短了胚胎与冷冻保护剂溶液的接 触时间,进一步提高了冷冻效率。 在辅助生殖技术领域,Cryoloop超速玻璃化 冷冻人囊胚获得了较高的妊娠分娩率,结果 比开放型拉细麦答(OPS)、普通麦管玻璃和 CPS能更好的保存胚胎的形态和活力。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。
• 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
2、一步冷冻法
利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前 脱水,从而减少冷冻过程中细胞内冰晶 的形成。其特点是胚胎在室温脱水后 不需要特殊的降温程序,能在很短得时 间内完成冷冻过程,具有重要的实用价 值。
3、玻璃化法(vitrification)
Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷 冻胚胎的方法,即可用几种保护剂混合组 成一种玻璃化(vitrificationsolution,VS), 它在低温时变的很粘稠,不发生结晶就可 固化,形成不规则结构的玻璃样固体,能 保持液态时正常的分子和离子分布,因而 用玻璃化液进行胚胎冷冻前处理有较好 的保护效果。
从冷冻技术第一次成功应用于人类胚
胎并获妊娠至今,有关技术、方法不断成熟。 据报道,正常胚胎移植的妊娠失败率可达到 40%～60%,冷冻胚胎尤其是冷冻IVF人胚胎 成功率就更低,一些研究结果认为,8～16细 胞的人胚胎冷冻效果较好,也有认为,4细胞 期胚胎冷冻后的成活率也不低。
从总体上讲,冻胚移植的妊娠率比 鲜胚低,影响人类胚胎冷冻保存结果的 因素是多方面的,主要有胚胎的质量(大 小、渗透性等)和分裂(发育)阶段、母 体年龄及移植时机以及冷冻保护剂(渗 透性、毒性等)和冷冻溶解程序等几方 面。
玻璃化冷冻方法简单、快速,防止了冰 晶对胚胎造成的损伤,但由于玻璃化溶液的 浓度极高且溶质存在毒性,会使胚胎的成活 率降低,所以当今研究热点集中在如何减少 高浓度溶液对胚胎的毒害作用。
另细胞是否
发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
胞质部分脱水后的玻璃化和胞外溶液
的部分玻璃化是有效冷冻保存胚胎的重
要因素。胚胎在这种玻璃样固体中脱水 到一定程度,可引起内源性胞质大分子 (如蛋白质) 及已渗入白细胞内的冷冻保 护剂浓缩,从而使细胞在降温过程中得到 保护。
• 玻璃化冷冻具有许多冷存液没有的优
点操作简单、快捷、价格便宜、不需要
优势
• 可以合理限制移植胚胎数，降低多胎妊娠 率。
• 为胚胎移植失败或流产患者提供再次移植 机会,不必反复进行女性超促排卵。
• 在超排卵周期出现卵巢过度刺激综合征迹 象时，取消胚胎移植，将胚胎进行冷冻保 存，在其后非刺激周期进行冷冻胚胎移植。
方法
1、常规缓慢冷冻
此方法需专用的冷冻仪,可获得较高的 移植妊娠率,是目前生产中广泛采用并 且最为成功的冷冻方法。冷冻液一般 为1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的 PBS)。
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。
2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。
北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。
• 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。
• 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
• 超速玻璃化冷冻
是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、 Cryotop和电镜铜珊(EMG)等,通过极度 缩小含胚胎玻璃化溶液的体积来实现 “即时玻璃化”,使降温速率由普通玻 璃化的2000℃/min提高到20000℃/min 以上,有效避免了细胞内冰晶形成,并 减轻了寒冷损伤,提高了冷冻效率。
• 1985年Rau和Fahy用高浓度的DMSO、乙 酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成玻璃化 溶液，对8细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷 冻实验，获得87.5%的冻后发育率。此后。 牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后应 用玻璃化冷冻法获得成功。目前该技术已 广泛应用于畜牧生产。
原理
• 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过 慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第56天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静 止下来并可在-196度的液氮中保存的 一种方法。
与传统玻璃化冷冻方法比较
超速玻璃化冷冻一方面提高了降温速率,另 一方而缩短了胚胎与冷冻保护剂溶液的接 触时间,进一步提高了冷冻效率。 在辅助生殖技术领域,Cryoloop超速玻璃化 冷冻人囊胚获得了较高的妊娠分娩率,结果 比开放型拉细麦答(OPS)、普通麦管玻璃和 CPS能更好的保存胚胎的形态和活力。