胚胎冷冻技术 ppt课件

优势
• 可以合理限制移植胚胎数，降低多胎妊娠 率。
• 为胚胎移植失败或流产患者提供再次移植 机会,不必反复进行女性超促排卵。
• 在超排卵周期出现卵巢过度刺激综合征迹 象时，取消胚胎移植，将胚胎进行冷冻保 存，在其后非刺激周期进行冷冻胚胎移植。
方法
1、常规缓慢冷冻
此方法需专用的冷冻仪,可获得较高的 移植妊娠率,是目前生产中广泛采用并 且最为成功的冷冻方法。冷冻液一般 为1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的 PBS)。
医疗应用
• 若有剩余的质量较好的胚胎，可以冷冻保存，待 以后自然周期或人工周期解冻后植入子宫腔内， 将增加受孕的机会。
• 可用于一个超排卵周期得到的胚胎数量多，质量 好，不能一次全部移植，可将多余的胚胎冷冻保 存。
• 以及发生严重卵巢过度刺激综合征的患者，不宜 在治疗周期移植胚胎者，可将胚胎冷冻，待以后 的自然周期或人工周期进行胚胎复苏移植。
人类胚胎冷冻的应用现状
到目前为止,超低温冷冻人的体外受精(IVF)胚 胎,在国内外均获得成功。
2004年,意大利学者应用ICSI对慢速冷冻卵母 细胞与冻融睾丸精子受精后再次冻存多余胚胎,解 冻胚胎移植后分娩一健康女婴,为世界首例。
北京大学第三医院生殖医学中心应用冷冻精 液中精子、冷冻卵母细胞、冷冻胚胎即“三冻” 技术,成功获得世界第2例、我国第1例“三冻”婴 儿。并在卵母细胞冷冻技术方而,采用了与世界首 例不同的简捷的玻璃化冷冻卵母细胞的方法。
另外,从理论上讲,冷冻胚胎可长期 保存,但对于保存过程中胚胎细胞是否
发生老化的问题还缺乏直接的实践证 据;对于冷冻效果鉴定,主要采用形态学 方法鉴定冻胚质量,对其移植后的发育 潜力无法判断。
• 在多种冷冻方法中,现较多采用慢速冷 冻、快速溶解方法,但是其他方法也有 其自身优点。因此,在实验中应综合考 虑多方面因素,根据具体的胚胎情况选 择恰当的方法。
从冷冻技术第一次成功应用于人类胚
胎并获妊娠至今,有关技术、方法不断成熟。 据报道,正常胚胎移植的妊娠失败率可达到 40%～60%,冷冻胚胎尤其是冷冻IVF人胚胎 成功率就更低,一些研究结果认为,8～16细 胞的人胚胎冷冻效果较好,也有认为,4细胞 期胚胎冷冻后的成活率也不低。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
从总体上讲,冻胚移植的妊娠率比 鲜胚低,影响人类胚胎冷冻保存结果的 因素是多方面的,主要有胚胎的质量(大 小、渗透性等)和分裂(发育)阶段、母 体年龄及移植时机以及冷冻保护剂(渗 透性、毒性等)和冷冻溶解程序等几方 面。
玻璃化冷冻方法简单、快速,防止了冰 晶对胚胎造成的损伤,但由于玻璃化溶液的 浓度极高且溶质存在毒性,会使胚胎的成活 率降低,所以当今研究热点集中在如何减少 高浓度溶液对胚胎的毒害作用。
• 1985年Rau和Fahy用高浓度的DMSO、乙 酰胺、丙二醇和聚乙二醇分别组成玻璃化 溶液，对8细胞期的小鼠胚胎进行了一步冷 冻实验，获得87.5%的冻后发育率。此后。 牛、绵羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后应 用玻璃化冷冻法获得成功。目前该技术已 广泛应用于畜牧生产。
原理
• 将胚胎和冷冻液装入冷冻管中，经过 慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第56天的囊胚）两种降温方式使胚胎能静 止下来并可在-196度的液氮中保存的 一种方法。
玻璃化冷冻技术正处于实验研究到临 床应用的过渡阶段,随着玻璃化冷冻方法的 逐渐成熟,有望成为程序冷冻方法外的另一 种选择。
• 超速玻璃化冷冻
是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、 Cryotop和电镜铜珊(EMG)等,通过极度 缩小含胚胎玻璃化溶液的体积来实现 “即时玻璃化”,使降温速率由普通玻 璃化的2000℃/min提高到20000℃/min 以上,有效避免了细胞内冰晶形成,并 减轻了寒冷损伤,提高了冷冻效率。
胞质部分脱水后的玻璃化和胞外溶液
的部分玻璃化是有效冷冻保存胚胎的重
要因素。胚胎在这种玻璃样固体中脱水 到一定程度,可引起内源性胞质大分子 (如蛋白质) 及已渗入白细胞内的冷冻保 护剂浓缩,从而使细胞在降温过程中得到 保护。
• 玻璃化冷冻具有许多冷存液没有的优
点操作简单、快捷、价格便宜、不需要
与传统玻璃化冷冻方法比较
超速玻璃化冷冻一方面提高了降温速率,另 一方而缩短了胚胎与冷冻保护剂溶液的接 触时间,进一步提高了冷冻效率。 在辅助生殖技术领域,Cryoloop超速玻璃化 冷冻人囊胚获得了较高的妊娠分娩率,结果 比开放型拉细麦答(OPS)、普通麦管玻璃和 CPS能更好的保存胚胎的形态和活力。
特殊设备,避免细胞内外冰晶形成,更重 要的是其粘滞性高,在6℃冷存后形成的 玻璃样结构,保持了分子、离子正常的扩 散与分配,细胞内物冰晶形成,维持了正 常的细胞超微结构,减少了对透明带和基 因的损害,提高了冷冻存活率和妊娠率。
临床应用
应充分重视高浓度玻璃化冷冻溶液对胚 胎的毒性作用,合理选择玻璃化冷冻溶液,严 格控制胚胎和玻璃化冷冻溶液接触的总时间。 目前较简单的玻璃化溶液的组成是25%甘油、 25%PROH或25%乙二醇。
胚胎冷冻技术
发展历史
• 胚胎冷冻保存的研究起始于20世纪50年代， 当时Smith用甘油坐防冻剂，保存兔胚胎获 得成功。
• 1971年Whittingham用慢速冷冻方法获得小 鼠胚胎的成功保存。
• 1978年willadsen建立了快速冷冻方法。 1984年Takeda等采用一步冷冻方法首次冷 冻小鼠胚胎获得成功。
2、一步冷冻法
利用高浓度的抗冻剂使胚胎在冷冻前 脱水,从而减少冷冻过程中细胞内冰晶 的形成。其特点是胚胎在室温脱水后 不需要特殊的降温程序,能在很短得时 间内完成冷冻过程,具有重要的实用价 值。
3、玻璃化法(vitrification)
Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷 冻胚胎的方法,即可用几种保护剂混合组 成一种玻璃化(vitrificationsolution,VS), 它在低温时变的很粘稠,不发生结晶就可 固化,形成不规则结构的玻璃样固体,能 保持液态时正常的分子和离子分布,因而 用玻璃化液进行胚胎冷冻前处理有较好 的保护效果。