蛋白质层析技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物 大分子失活，没 有生物化学毒性：过强吸 附，泄漏，氧化还原性
化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件 下是稳定的. pH,络合物,巯基化合物…
必要的机械性能: 流体中的耐压性
2022/3/23
结构:典型层析介质的放大观察
• 下图:2%agarose gel 白 线段: 500nm
• 层析的动力学分析：塔板理论（板高方程 ）
•Байду номын сангаас层析是最强有力的分离手段
2022/3/23
液相层析
➢ 生化分离技术，基因工程技术和免疫
学技术并称为生物技术
（Biotechnology） ➢ 液相层析是生物大分子分离纯化的最
重要手段
2022/3/23
蛋白液相层析的应用
➢ 已知和未知蛋白质的纯化
o 结构、动力学、药物作用靶点研究对 高纯蛋白的需要
2. 蛋白样品的富集和浓缩 3. 脱气
➢ 纯化过程中样品处理
1. 脱盐和缓冲液交换 2. 去污剂的去除 3. 离子污染物的去除 4. 其它的处理和浓缩
2022/3/23
分离纯化机制
Charged Groups
(asp, glu, lys, arg, his) Ion Exchange and Chromatofocusing
2022/3/23
层析介质颗粒度与动态载量
• 小颗粒传质更迅速，动 态载量更高
• IgG1在不同颗粒度的 Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰 石上的动态载量比较
• Buffer-0.05M MES,pH6.5;
• Flow rate: 600cm/hr
2022/3/23
吸附动力学与动态载量
• 长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作 用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关
➢ 层析仪
o 蛋白分析和纯化实现的设备
2022/3/23
蛋白液相层析的一般程序
➢样品处理 ➢选择分离机制建立初步纯化流程 ➢流程优化 ➢放大 ➢Polishing(精细纯化)
2022/3/23
样品制备
➢ 一般性处理
1. 去处颗粒物——5 µm、2 µm、0.45 µm 分级过滤，0.2 µm除菌
2022/3/23
影响分辨率的因素
➢ 柱效依赖于层析介质对样品的选 择性和分离带宽.
➢ 在多孔颗粒介质的柱子中带宽或 柱效表示为： H =2d+B/V+Cmd2V + Csd2V
▪ d=层析介质离子直径 ▪ =填充不规则因子 ▪ H = Plate height塔板高度或柱效 ▪ A = Eddy diffusion涡流扩散 ▪ B = Longitudinal molecular diffusion径向
蛋白质层析技术
2022/3/23
蛋白质层析介质
蛋白质层析技术
蛋白分离纯化平台
及单抗的分离纯 化
2022/3/23
蛋白质层析的原理和要点
2022/3/23
层析的概念
流动相
固定相 洗脱峰
2022/3/23
1 2 3
C流出组份 1 2 3
层析一般地是一种物理方法
• 层析的热力学分析：分配; 吸附等温线；吸 附---脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线 性过程
2022/3/23
基体孔结构决定传质特点
• 孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散 越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反
2022/3/23
动态载量（Dynamic Capacity ）
• 动态载量是制备层析的 重要概念：层析过程是 偏离平衡态的，流速越 大，偏离越远，反之亦 反
• 动态载量是制备层析介 质的重要性能指标，更 快更高是人类活动的重 要目标
扩散(可忽略) ▪ Cm = non-equilibrium mass transfer in the
mobile phase流动相非平衡物质转移 ▪ Cs = non-equilibrium mass transfer in the
Hydrophobic Region
(phe, trp, ile, leu, val, gly, ala, tyr)
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
Thiol Groups
(cys) Covalent Chromatography
蛋白质层析介质基体 须具备的特性
• 右图:Sephacryl S-500 • 右上:白线段 10um • 右下:白线段0.5um
2022/3/23
化学组成:亲水多孔高聚物等
• 天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼 脂糖及共聚物----孔径分布宽,较软
• 合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类 ,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理 的聚苯烯类
o 免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制 备
o 基因工程药物生产
➢ 基因治疗对大量质粒的需要
2022/3/23
蛋白液相层析的构成
➢ 分析型层析柱和制备型层析柱
o 分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范 围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法
o 制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性 范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化 样品获得蛋白产物
• 无机化合物: 硅胶, 羟基磷灰石, 氧化锆
2022/3/23
聚合物基体(matrix)孔的结构
• 孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相 应于低交联度
• 高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身 微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸 附层析
2022/3/23
孔的结构可分为三种类型
• 标志产品: SepharoseHP，Toyopearl； MacroPrep，UNOSphere，SOURCE； UNOQ，POROS
2022/3/23
从动态载量看上样条件
• BSA在阴离子交换介质上的动态载量： • 吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂
强度远比对其洗脱体积敏感
2022/3/23
吸附蛋白的大小与动态载量
• 层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实 际用来吸附蛋白的量
• 小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更 加敏感
Hydroxyapatite
Electrostatic Coordination complexesRepulsionGeometric charge distribution-
Size and Shape
Gel Filtration
2022/3/23
Binding Site
Biospecific Affinity Chromatography
化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件 下是稳定的. pH,络合物,巯基化合物…
必要的机械性能: 流体中的耐压性
2022/3/23
结构:典型层析介质的放大观察
• 下图:2%agarose gel 白 线段: 500nm
• 层析的动力学分析：塔板理论（板高方程 ）
•Байду номын сангаас层析是最强有力的分离手段
2022/3/23
液相层析
➢ 生化分离技术，基因工程技术和免疫
学技术并称为生物技术
（Biotechnology） ➢ 液相层析是生物大分子分离纯化的最
重要手段
2022/3/23
蛋白液相层析的应用
➢ 已知和未知蛋白质的纯化
o 结构、动力学、药物作用靶点研究对 高纯蛋白的需要
2. 蛋白样品的富集和浓缩 3. 脱气
➢ 纯化过程中样品处理
1. 脱盐和缓冲液交换 2. 去污剂的去除 3. 离子污染物的去除 4. 其它的处理和浓缩
2022/3/23
分离纯化机制
Charged Groups
(asp, glu, lys, arg, his) Ion Exchange and Chromatofocusing
2022/3/23
层析介质颗粒度与动态载量
• 小颗粒传质更迅速，动 态载量更高
• IgG1在不同颗粒度的 Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰 石上的动态载量比较
• Buffer-0.05M MES,pH6.5;
• Flow rate: 600cm/hr
2022/3/23
吸附动力学与动态载量
• 长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作 用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关
➢ 层析仪
o 蛋白分析和纯化实现的设备
2022/3/23
蛋白液相层析的一般程序
➢样品处理 ➢选择分离机制建立初步纯化流程 ➢流程优化 ➢放大 ➢Polishing(精细纯化)
2022/3/23
样品制备
➢ 一般性处理
1. 去处颗粒物——5 µm、2 µm、0.45 µm 分级过滤，0.2 µm除菌
2022/3/23
影响分辨率的因素
➢ 柱效依赖于层析介质对样品的选 择性和分离带宽.
➢ 在多孔颗粒介质的柱子中带宽或 柱效表示为： H =2d+B/V+Cmd2V + Csd2V
▪ d=层析介质离子直径 ▪ =填充不规则因子 ▪ H = Plate height塔板高度或柱效 ▪ A = Eddy diffusion涡流扩散 ▪ B = Longitudinal molecular diffusion径向
蛋白质层析技术
2022/3/23
蛋白质层析介质
蛋白质层析技术
蛋白分离纯化平台
及单抗的分离纯 化
2022/3/23
蛋白质层析的原理和要点
2022/3/23
层析的概念
流动相
固定相 洗脱峰
2022/3/23
1 2 3
C流出组份 1 2 3
层析一般地是一种物理方法
• 层析的热力学分析：分配; 吸附等温线；吸 附---脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线 性过程
2022/3/23
基体孔结构决定传质特点
• 孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散 越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反
2022/3/23
动态载量（Dynamic Capacity ）
• 动态载量是制备层析的 重要概念：层析过程是 偏离平衡态的，流速越 大，偏离越远，反之亦 反
• 动态载量是制备层析介 质的重要性能指标，更 快更高是人类活动的重 要目标
扩散(可忽略) ▪ Cm = non-equilibrium mass transfer in the
mobile phase流动相非平衡物质转移 ▪ Cs = non-equilibrium mass transfer in the
Hydrophobic Region
(phe, trp, ile, leu, val, gly, ala, tyr)
Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)
Thiol Groups
(cys) Covalent Chromatography
蛋白质层析介质基体 须具备的特性
• 右图:Sephacryl S-500 • 右上:白线段 10um • 右下:白线段0.5um
2022/3/23
化学组成:亲水多孔高聚物等
• 天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼 脂糖及共聚物----孔径分布宽,较软
• 合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类 ,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理 的聚苯烯类
o 免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制 备
o 基因工程药物生产
➢ 基因治疗对大量质粒的需要
2022/3/23
蛋白液相层析的构成
➢ 分析型层析柱和制备型层析柱
o 分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范 围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法
o 制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性 范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化 样品获得蛋白产物
• 无机化合物: 硅胶, 羟基磷灰石, 氧化锆
2022/3/23
聚合物基体(matrix)孔的结构
• 孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相 应于低交联度
• 高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身 微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸 附层析
2022/3/23
孔的结构可分为三种类型
• 标志产品: SepharoseHP，Toyopearl； MacroPrep，UNOSphere，SOURCE； UNOQ，POROS
2022/3/23
从动态载量看上样条件
• BSA在阴离子交换介质上的动态载量： • 吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂
强度远比对其洗脱体积敏感
2022/3/23
吸附蛋白的大小与动态载量
• 层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实 际用来吸附蛋白的量
• 小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更 加敏感
Hydroxyapatite
Electrostatic Coordination complexesRepulsionGeometric charge distribution-
Size and Shape
Gel Filtration
2022/3/23
Binding Site
Biospecific Affinity Chromatography