细菌内毒素检测
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• λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔EU/ml)
1mL
1mL
1mL
1mL
C组
4λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
1mLBET水 0.5mL
1mLBET水 0.5mL
1mLBET水
1mLBET水
0.5mL
0.5mL
B组
4λ
2λ
λλ
0.5mL供试 品溶液
0.5mL供试 品溶液
0.5λ
0.25λ
0.5mL供试 品溶液
• Es=antilg(∑Xs/4)
• Et=antilg(∑Xt/4) • 式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度
的对数值(lg)。
• 当Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包 括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用 。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干 扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释， 再重复干扰试验。
细菌内毒素检测浅析
• 细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌 细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源 性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之 释放出一种内源性热原质，作用于体温调 节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学 成分为脂多糖。
鲎试剂与细菌内毒素的凝胶反应的作 用机理
• 鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是鲎的 血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内 有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。 当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂） 接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固 蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝 胶状态。
0.5mL供试 品溶液
结果
1
A 2λ λ
B 0.5λ 0.25λ 2λ λ
C 0.5λ 0.25λ
D
2
3
4
－
－
－
－
• 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性 ，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内 时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应 终点浓度的几何平均值(Es和Et):
MVD=cL/λ
• 式中 L为供试品的细菌内毒素限值；
• c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的 单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌 粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最 小有效稀释浓度c=λ/L；
0.9mL
1EU/mL 0.9mLBET水
0.3mLBET水
0.3mL
内毒素标 准 溶液
4λ
0.9mLBET水 0.3mL供试品溶液
0.3mL
2λ
0.3mLBET水
0.3mL供试品溶液
百度文库供试品溶液
供试品阳性对 照溶液
结果 样品1 样品2 样品3
供试品组
供试品阳性对照 组
阴性对 阳性对
照结果 照结果
,
• 式中 X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点 浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳 性结果的浓度。
• 当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌 内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵 敏度。
干扰试验
• 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试 品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大 有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏 度复核试验项下操作。
0.9mLBET水
λ
0.5λ
0.9mLBET水 0.9mLBET水
0.25λ 0.9mLBET水
结果
1
2
3
4
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
• 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为 阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效．按下 式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂 灵敏度的测定值(λc)。 λc＝antilg(∑X/4)
• 当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境 中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新 进行干扰试验。
检测
• 按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍 数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液 来制备溶液A和B。
0.1mL
100EU/mL 0.1mL
10EU/mL 0.9mLBET水
• 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜 的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰 。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会 使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再 经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
• 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项 的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
,
结论 合格 不合格 合格 不合格 合格 不合格
…….
合格 不合格
鲎试剂灵敏度复核的意义
(1)考查操作技能 (2)考查实验条件 (3)验证鲎试剂灵敏度是否准确，鲎试剂在生产、销
售、运输、储存过程中易受诸如温度、光线、时 间等外界因素的影响，使促凝活力降低 (4)验证细菌内毒素标准品的效价是否准确
因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性， 检验者应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复
凝胶法检测细菌内毒素的步骤
鲎试剂的灵敏度复核 ↓
干扰实验 ↓
检测
鲎试剂的灵敏度复核
•
细菌内毒素检查法至药典收载以来，每版都有明 确规定：每使用新批量的鲎试剂或试验条件发生 了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂 灵敏度的复核试验。
• 鲎试剂的灵敏度，即鲎试剂在本试验法规定的条 件下能检测出的细菌内毒素标准液或供试品溶液 中的最低内毒素浓度（用 Eu/ml 表示)
核
0.1mL 鲎试剂灵敏度复核
100EU/mL
0.1mL
0.9mL
10EU/mL 0.9mLBET水
1EU/mL 0.9mLBET水
0.9mL
2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度每个平行4 管，另加两管BET水做阴性对照.
0.9mL
0.9mL
0.9mL
0.5EU/mL,4λ 2λ 0.9mLBET水
1mL
1mL
1mL
1mL
C组
4λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
1mLBET水 0.5mL
1mLBET水 0.5mL
1mLBET水
1mLBET水
0.5mL
0.5mL
B组
4λ
2λ
λλ
0.5mL供试 品溶液
0.5mL供试 品溶液
0.5λ
0.25λ
0.5mL供试 品溶液
• Es=antilg(∑Xs/4)
• Et=antilg(∑Xt/4) • 式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度
的对数值(lg)。
• 当Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包 括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用 。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干 扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释， 再重复干扰试验。
细菌内毒素检测浅析
• 细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌 细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源 性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之 释放出一种内源性热原质，作用于体温调 节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学 成分为脂多糖。
鲎试剂与细菌内毒素的凝胶反应的作 用机理
• 鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是鲎的 血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内 有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。 当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂） 接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固 蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝 胶状态。
0.5mL供试 品溶液
结果
1
A 2λ λ
B 0.5λ 0.25λ 2λ λ
C 0.5λ 0.25λ
D
2
3
4
－
－
－
－
• 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性 ，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内 时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应 终点浓度的几何平均值(Es和Et):
MVD=cL/λ
• 式中 L为供试品的细菌内毒素限值；
• c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml 表示时，则c 等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的 单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌 粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最 小有效稀释浓度c=λ/L；
0.9mL
1EU/mL 0.9mLBET水
0.3mLBET水
0.3mL
内毒素标 准 溶液
4λ
0.9mLBET水 0.3mL供试品溶液
0.3mL
2λ
0.3mLBET水
0.3mL供试品溶液
百度文库供试品溶液
供试品阳性对 照溶液
结果 样品1 样品2 样品3
供试品组
供试品阳性对照 组
阴性对 阳性对
照结果 照结果
,
• 式中 X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点 浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳 性结果的浓度。
• 当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌 内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵 敏度。
干扰试验
• 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试 品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大 有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏 度复核试验项下操作。
0.9mLBET水
λ
0.5λ
0.9mLBET水 0.9mLBET水
0.25λ 0.9mLBET水
结果
1
2
3
4
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
• 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为 阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效．按下 式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂 灵敏度的测定值(λc)。 λc＝antilg(∑X/4)
• 当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境 中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新 进行干扰试验。
检测
• 按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍 数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液 来制备溶液A和B。
0.1mL
100EU/mL 0.1mL
10EU/mL 0.9mLBET水
• 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜 的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰 。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会 使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再 经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
• 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项 的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
,
结论 合格 不合格 合格 不合格 合格 不合格
…….
合格 不合格
鲎试剂灵敏度复核的意义
(1)考查操作技能 (2)考查实验条件 (3)验证鲎试剂灵敏度是否准确，鲎试剂在生产、销
售、运输、储存过程中易受诸如温度、光线、时 间等外界因素的影响，使促凝活力降低 (4)验证细菌内毒素标准品的效价是否准确
因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性， 检验者应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复
凝胶法检测细菌内毒素的步骤
鲎试剂的灵敏度复核 ↓
干扰实验 ↓
检测
鲎试剂的灵敏度复核
•
细菌内毒素检查法至药典收载以来，每版都有明 确规定：每使用新批量的鲎试剂或试验条件发生 了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂 灵敏度的复核试验。
• 鲎试剂的灵敏度，即鲎试剂在本试验法规定的条 件下能检测出的细菌内毒素标准液或供试品溶液 中的最低内毒素浓度（用 Eu/ml 表示)
核
0.1mL 鲎试剂灵敏度复核
100EU/mL
0.1mL
0.9mL
10EU/mL 0.9mLBET水
1EU/mL 0.9mLBET水
0.9mL
2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度每个平行4 管，另加两管BET水做阴性对照.
0.9mL
0.9mL
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0.5EU/mL,4λ 2λ 0.9mLBET水