沈阳药科大学药剂学课件生物技术药物制剂

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（1）旋光性：蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋， 它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大
（2）紫外吸收：大部分蛋白质均含有带苯核的苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外 280nm有最大吸收。氨基酸在紫外230nm显示强吸收
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2．表面活性剂
在蛋白质药物的制剂中加入少量非离子表面活性剂能抑制蛋白质的聚集 机理可能是因为表面活性剂倾向于排列在气—液界面上，从而使蛋白质离开界面来抑制蛋白 质的变性 离子型表面活性剂会引起蛋白质的变性
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3．糖和多元醇
糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂 蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇（浓度1%~10%）最常用 糖和多元醇的稳定作用与其浓度密切相关 不同糖和多元醇的稳定程度取决于蛋白质的种类 还原糖与氨基酸有相互作用，因此避免使用
近十几年来，生物技术在医药方 面取得了惊人的成就，已有不少生
物技术药物应用于临床
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二、生物技术药物的研究概况（了解）
目前国内外已批准上市的生物技术药物产品约40余种，见表19-1 正在研究的有数百种之多，部分正在研究的生物技术或其他来源的药物列于表19-2中，这些 药物均属肽类与蛋白质类药物 随着生物技术药物的发展，肽和蛋白质药物制剂的研究与开发，已成为医药工业中一个重要 的领域 也给药物制剂带来了新的挑战
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4．生物活性测定与免疫测定
蛋白质药物制剂的稳定性也应检测其生物活性 生物活性检测是利用体内模型或体外组织或活性蛋白质多肽的特异性生物学反应，通过剂量 （或浓度）效应曲线进行定量 生物活性测定是制订这类药物制剂质量标准的最基本方法
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免疫测定
免疫测定通常是采用免疫化学法 这种建立在沉淀反应基础上的免疫化学方法非常适合于蛋白质的定性及定量分析、蛋白质制 剂（混杂有其它蛋白质）的均一性试验以及蛋白质混合物组分的鉴定 与其它方法相比较，主要优点是可用于定量化学分析不能检测的情况，例如测定蛋白质混合 物的一种组分
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（2）由非共价键引起的不稳定性
引起蛋白质不可逆失活作用的下列主要类型，即聚集、宏观沉淀、表面吸附与蛋白质变性 这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起 这些现象在开发蛋白质与多肽类药物制剂中常会带来许多困难
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（三）蛋白质类药物的评价方法
1．液相色谱法 液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性的常用方法 在蛋白质分析中通常采用： I. 反相高效液相色谱法（RP-HPLC） II. 离子交换色谱法（IEC） III. 分子排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）
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6．大分子化合物
研究表明很多大分子化合物具有稳定蛋白质的作用 其机制可能是通过大分子的表面活性、蛋白质-蛋白质相互作用的空间隐蔽以及提高粘度来限 制蛋白质运动或通过优先吸附于大分子以起到稳定作用 人血清白蛋白（HAS）已在许多蛋白质类生物技术来源的药物制剂中作稳定剂 2-羟丙基--环糊精是较有前途的稳定剂，其本身又是增溶剂可静脉注射，可用来抑制hGH的 界面变性，抑制rhKGF的聚集，稳定白介素-2和牛胰岛素等
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三、生物技术药物的结构特点与理化性质 （一）蛋白质的结构特点
1．蛋白质的组成和一般结构
蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序排列，通过肽键相连而成的多肽链 蛋白质分子量很大，一般在5×103~5×106 蛋白质的肽链结构包括氨基酸组成、氨基酸排列顺序、肽链数目、末端组成和二硫键的位置等 组成蛋白质的氨基酸有20多种 肽、多肽、肽键、氨基酸序列
第十九章 生物技术药物制剂
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大纲要求
掌握：生物技术的基本概念，生物技术药物的结构特点与理化性质，蛋白质类药物的一般处 方组成，液体剂型中蛋白质类药物的稳定化 熟悉: 固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺 了解：生物技术药物的研究概况，非注射给药系统，新型注射(植入)给药系统
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蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构 一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置； 二、三、四级结构为高级结构或空间结构 高级结构和二硫键对蛋白质的生物活性有重要影响
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2．蛋白质的高级结构
二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有螺 旋结构与折叠形式 三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列 或组合方式系一条多肽链中所有原子的空间排布 四级结构是指具有三级结构的蛋白质各亚基聚合而成的大分子蛋白质
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3）外消旋作用
某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D或L-型化合物转变为D-型和L-型各50％的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称 为外消旋作用 当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用 影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH值、离子强度和金属离子螯合作用 蛋白质中氨基酸的消旋作用一般能使氨基酸成为非代谢的形式
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反相高效液相色谱法（RP-HPLC）
固定相应有较宽范围的孔体积（直径约300nm或更大） 流动相一般用不同浓度的乙腈水溶液，并含有离子对试剂 应用反相 HPLC法会使一些蛋白质变性 广泛应用于胰岛素制剂的质量分析
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2．光谱法
用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外（UV）、可见吸收光谱、旋光色散（ORD）、圆二色 谱（CD）、荧光、红外（IR）和拉曼（Raman）光谱 紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度 光散射可测定制剂中蛋白质的聚集数量 蛋白质的远紫外圆二色谱直接反映蛋白质的二级结构
形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力、离子键、范德华力、二硫键与配位 键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力
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（二）蛋白质的理化性质
1．蛋白质的一般理化性质
蛋白质的分子量 蛋白质在水中形成亲水胶体，颗粒大小在l nm ~100nm之间 它不能透过半透膜 由于蛋白质分子中存在极性基团如-NH3+、-COO-、-NH2、-OH、-SH等，可形成水化 层而稳定
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3．电泳
电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷及 其大小的函数，以此来分离混合蛋白质 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电点聚焦（isoclectric focusing，IEF） 和新的毛细管电泳（EC）法 本法用于测定蛋白质亚单位组成和分子量，可取得满意效果
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4）二硫键断裂及其交换
二硫键（-S-S-）又叫二硫桥或硫硫桥，是很强的化学键 它是由两个半胱氨酸侧链上的-SH巯基脱氢相连而成 二硫键把同一肽链（肽链内）或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起 重要作用 在某些蛋白质中，二硫键一旦破坏，蛋白质的生物活性即丧失，蛋白质分子中二硫键数目愈多，则 结构稳定性和抗拒外界因素的能力也愈强 蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性
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挑战
① 生物技术产品多为多肽和蛋白质类，性质很不稳定，极易变质—稳定性 ② 这类药物对酶敏感又不易穿透胃肠粘膜，故只能注射给药，使用很不方便 ——顺应性
运用制剂手段将这类药物制成口服制剂或通过其他途径给药，以提高其稳定性和患者使用的顺应 性，是一项非常有意义的工作，具有潜在的研究价值和广阔的应用前景
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第二节 蛋白质类药物制剂的处方与工艺
蛋白质类药物制剂的研制关键是解决这类药物的稳定性问题 对于注射给药则采用适当的辅料，设计合理的处方与工艺 而非注射给药还需解决生物利用度问题
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一、蛋白质类药物的一般处方组成
目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一类为溶液型注射剂，另一类是冻干粉注射剂 溶液型使用方便，但需在低温（2~8℃）下保存 冻干粉型比较稳定，但工艺较为复杂
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蛋白质高级结构示意图
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蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中 所有原子在三维空间中的排布
这种空间排布的ห้องสมุดไป่ตู้化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂
蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象时才有生物活性
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4．盐类
盐可以起到稳定蛋白质的作用，有时也可以破坏蛋白质的稳定性 主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷
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5．聚乙二醇类
高浓度的聚乙二醇类常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀结晶剂 研究表明不同分子量的PEG作用不同，如PEG300浓度0.5%或2%可抑制重组人角化细 胞生长因子（rhKGF）的聚集；PEG200、400、600和1000可稳定BSA和溶菌酶
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二、液体剂型中蛋白质类药物的稳定化
在液体剂型中蛋白质类药物的稳定化方法分为两类： ①改造其结构（该方法不属于制剂学范畴） ②加入适宜辅料：通过加入各类辅料，改变蛋白类
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