胰蛋白酶活力测定
实验六胰蛋白酶活力的测定
稀释后Ty（μg/ml） 0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml) 酚试剂(ml)
A680nm
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2、蛋白酶活力的测定
管号
1号(样 品) 2号(对 照)
酶液 （ml）
1
A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
因。 如何保证本实验测定数据的准确性？
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚 试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物， 它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产 生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm）
3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而 推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰 蛋白酶的活力。
4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下， 水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
胃蛋白酶
计、凝
胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。
四、实验方法
1
．猪胰蛋白酶的分离纯化
（
1
）粗猪胰蛋白酶的提取
取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约
50g
加入
5
倍体积预冷的
pH2.5
乙酸酸化水
用组织捣碎机捣碎
离心
10000 rpm
，
15 min
用
4
层纱布过滤得上清液（
收集约
1.5 mL
，作为留样
1
，测蛋白含量，及时
SDS
化）
将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，
边加边搅拌均匀，
使溶液中最终
含有
0.1 mol/L CaCl
2
加入极少量猪胰蛋白酶（约
2-5mg
），轻轻搅拌均匀
用
5 mol/L NaOH
调
pH
为
8.0
于
25
℃下活化
4~6
小时（
2
小时取样一次），测定酶活性增加的情况
4
活化完成后，用
2.5 mol/L H
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
）混匀，
用酸度计检查
pH
值是否为
6.0
。
（
10
）
8
％三氯乙酸
（
11
）
10 mg/mL
酪蛋白溶液：
取酪蛋白
1g
，
加
11
M
Tris
－
HCl
缓冲液，
pH8.0
40
mL
【医学】胰蛋白酶的活力的测定
操作方法
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25℃予
热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一 比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读 数一次，共读3~4分钟。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸 光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。
国际系统分类
酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原 转变为有活性酶的过程称酶原激活。 同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学 反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。 别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分
子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。 酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0 ，
25℃，反应体积 3.0ml ，光径 1 厘米的条件下，测定 A253 ，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
酶活力与ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ反应速度
初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 时间 15 20
用于判断和确定酶活型中心的主要方法：
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
7 胰蛋白酶活力的测定
中国海洋大学实验报告姓名庞裕智专业年级生命基地班2011 题目胰蛋白酶活力的测定学号040312011025 科目生物化学实验时间周一90节同组者田特一、实验目的学习和掌握胰蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
三、实验仪器1、试管2、7220分光光度计3、恒温水浴锅四、实验试剂、1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml3、10%三氯乙酸溶液4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)五、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂：滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂六、实验结果酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳FA—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数F—酶液稀释倍数由标准曲线知，当OD680=0.244时，样品中酪氨酸的微克数为A=181ug ∴样品中胰蛋白酶活力单位为181/15×13=156.87七、实验分析1.注意事项（1）胰蛋白酶一定要刚提取的新鲜酶；（2）要在酶的最适温度40℃下反应；（3）要在酶的最适PH为7.5调节下反应；（4）催化反应的时间控制精确；（5）向样品测定的1号试管加入三氯醋酸时要快；（6）加入各种药品的量要精确，特别是酶。
胰蛋白酶比活力测定的实验操作
胰蛋白酶比活力测定的实验操作胰蛋白酶（trypsin）是一种重要的消化酶，用于蛋白质的降解。
测定胰蛋白酶的比活力可以评估其酶活性及纯度。
下面是测定胰蛋白酶比活力的实验操作步骤。
实验所需材料：1.胰酶溶液2. Brain Heart Infusion (BHI)培养基3. 丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对(L-Tyr-L-Phe)4.0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液5.0.1M硫酸（H2SO4）溶液实验步骤：1.准备酶样品：取适量的胰酶溶液，可以是商业制备的纯胰蛋白酶或者胰腺提取物。
2. 酶样品稀释：将胰酶溶液与BHI培养基按照一定比例混合，使得最终浓度在0.5-1.2mg/mL之间。
3.加入底物：向每个试管中加入20μL的丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-色氨酸对底物。
4.孵育反应：将试管置于37℃恒温培养箱中，在设定的时间内进行酶催化反应。
5.终止反应：用加入2NNaOH溶液终止酶反应，使底物水解停止。
6.酶解产物的提取：将反应液离心，取上清液转移到新的离心管中。
实验测量方法：1. 分光光度计法：利用胰酶催化底物水解产生的对分光光度计可见吸收的产物进行测定。
用1cm光程的比色皿，将底物水解产物的吸光度读数记录下来。
2. pH差比色法：用pH差比色法测量胰酶反应液中产生的酪氨酸分解产物。
黄色小麦胚芽酪氨酸（Tyr）的醛缩反应，其产物具有红色或紫色，在526nm处吸收峰。
通过比较不同样品的吸收度可以得出胰酶比活力。
数据处理：1.分光光度计法：根据底物水解产物的吸光度，绘制标准吸光度-底物浓度曲线，利用该曲线确定底物浓度，进一步计算胰酶的比活力。
2.pH差比色法：计算样品吸收值，将其与标准吸光度曲线相对应的底物浓度进行比较，计算胰酶的比活力。
注意事项：1.操作要严格遵守无菌技术，以避免细菌或其他污染物对实验结果的干扰。
2.实验过程中可以选择不同的底物和测量方法，以适应实验目的和条件。
3.实验操作需谨慎，避免接触眼睛和口腔，注意个人安全。
胰蛋白酶活性测定
胰蛋白酶活性测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
胰蛋白酶 药典标准
胰蛋白酶药典标准
胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，可用于提高肠道消化功能，改善胃肠道疾病。
胰蛋白酶的药典标准是按照国家药典制定的，以下是胰蛋白酶药典标准的相关参考内容：
【名称】胰蛋白酶
【药典标准】
1. 性状：胰蛋白酶为白色或几乎白色的粉末，无臭。
2. 酶活力测定：胰蛋白酶的酶活力以消化明胶法测定。
3. 蛋白含量测定：胰蛋白酶的蛋白含量以紫外吸收光度法测定。
4. 储存条件：胰蛋白酶应密封保存于阴凉干燥处，避免阳光直射。
【净含量】胰蛋白酶的净含量应符合生产商标注，一般以毫克或克为单位。
【适应症】胰蛋白酶广泛用于胃肠道消化功能减退，如慢性胰腺炎、胰腺切除术后，以及胃肠道手术后等。
【用法用量】成人常规剂量为每次口服胰蛋白酶20000-30000
单位，饭前或饭时服用。
具体剂量应根据患者消化功能及病情而定。
【不良反应】胰蛋白酶在正常剂量下一般不会引起不良反应，少数患者可能出现过敏反应如发热、皮疹、荨麻疹等，此时应停药并及时就医。
【注意事项】
1. 对胰蛋白酶过敏者禁用。
2. 胰蛋白酶可能与一些抗酸药物相互作用，如需要联用应在医生指导下进行。
3. 儿童、孕妇、哺乳期妇女及老年患者应在医生指导下使用。
【贮存期限】胰蛋白酶的贮存期限以生产商标注为准，一般为2-3年。
【生产企业】胰蛋白酶的生产企业应符合相关法规要求，具有药品生产许可证。
以上是胰蛋白酶药典标准的一些相关参考内容。
胰蛋白酶在临床上被广泛应用于改善消化功能减退的患者，但使用时应遵循医生的指导，且注意可能的不良反应和禁忌症等。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶活力测定的原理和方法
• 3、甲醛滴定法：用蛋白酶水解蛋白质生 成氨基酸。再用甲醛固定氨基酸的氨基， 用0.1N NaOH滴定生成的氨基酸的量，从 而测定酶活力。
• 4、DHT—酪蛋白法：用5-氨基四唑重氮盐将酪 蛋白中部分组氨酸和酷氨酸重氮化，得到黄色 的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以 DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生 成DHT-肽。二价镍离子可与DHT-蛋白及DHT-肽 形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅 速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合 适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂， 利用比色法可测定蛋白酶活力。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
十、胰蛋白酶的活力测定
• 测定时，取底物溶液3.0mL，加盐酸 （0.001mol/L）0.2mL混匀，作为空白。取供 试品溶液0.2mL与底物溶液（预热至25±0.5℃） 3.0mL，立即计时并摇匀，使比色池内的温度 保持在25±0.5℃，在253nm波长处，每隔30s 读吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间 为横坐标作图，取在3min内成直线部分的吸收 度计算分析。
• 1、福林—酚法：蛋白酶催化蛋白质水解 生成氨基酸。其中含酚基的氨基酸(酪氨 酸、色氨酸等)与福林—酚试剂反应，生
成蓝色复合物。蓝色深浅与含酚氨基酸
的量成正比，从而测定其活力。
蛋白质活性测定方法
核糖核酸酶（RNase）的活性测定（1）溶液的配制：①0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液：称取5.78 g CH3COONa, 加入1.7 mL CH3COOH, 用蒸馏水稀释至500 mL。
② 0.05 % RNase酵母溶液：称0.05 g RNase酵母，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100 mL。
测活方法：（2）用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中，加入一定量的样品RNase A溶液，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在300 nm波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，得到一组对应于时间t(min)的At值。
当样品管反应3小时后再测定300 nm处的吸光值A f, A f为最终的光吸收，分别求得一组对应于t的log(A t-A f), 以log(A t-A f)对时间t作图应得到线性关系，画出直线。
求出直线斜率的数值S，将S带入标准曲线，求得活性回收率。
将S带入下列公式中，可求出酶的活力。
单位/ mg = S × (-2.3) ×4 / (样品管中含酶的数量)胰凝乳蛋白酶（α-Chy）活性测定用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]：(1) 原理：α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体）的肽键。
我们可以通过在256 nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。
苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。
(2) 定义：一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8，温度为25 ℃时，每分钟水解1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。
(3) 试剂配置方法：Tris缓冲液(pH: 7.8)取0.969 g三（羟甲基）氨基甲烷和1.47 mg二水氯化钙溶于80 mL蒸馏水中，用1 N的盐酸将pH值调至7.8，并定容至100 mL。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
胰蛋白酶的活力的测定
操作方法
取2个光程为1厘米的石英比色杯，分别加入25℃预热 过 的 2.8ml 底 物 溶 液 。 向 一 只 比 色 杯 中 加 入 0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收 零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀 并记时，每半分钟读数一次，共读3~4分钟。
域，与催化作用直接相关。
活性中心
结合部位 （底物）
催化部位（底物的键在此处被打断或形成新 的键）
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸酶等。
国际系统命名法 分类 催化的反应性质不同 分称酶原。由无活性酶 原转变为有活性酶的过程称酶原激活。
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法 进行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英 文缩写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱 于苯甲酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白 酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸 逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：
以 BAEE 为 底 物 反 应 液 pH8.0 ， 25℃ ， 反 应 体 积 3.0ml ， 光 径 1 厘 米 的 条 件 下 ， 测 定 A253 ， 每 分 钟 使 A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单 位。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
酶活力测定方法
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。
加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法：
紫外-可见分光光度法 旋光法
荧光分光光度法
电化学测定法
酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
1。酶切条件
取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是 稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品 比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
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实验胰蛋白酶活力测定
一、原理
福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。
蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
试管
7220分光光度计
恒温水浴锅
三、实验试剂
福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml
10%三氯乙酸溶液
0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：
0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再
加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。
在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。
500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤
标准曲线的制作：按下表加入试剂：
0.20.40.60.81.0蒸馏水
1.0
0.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液6
54321管号
各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂
0 OD6801
1福林试剂B 5.0
5.0 0.55mol/L碳酸钠溶液
37水浴中显色15分钟1
1上清液
过滤3.0
3.0 10%三氯乙酸溶液1.0
0 2mg/ml胰酶溶液0
1.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液
37水浴中酶解15分钟2.0
2.0 0.5%酪素溶液
备注2
1
管号
五、结果计算
酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
原始数据：（注：7号为待测液）
液体编
号
0 1 2 3 4 5 7
分光光
度计值
0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 分光光
度计值
0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 分光光
度计值
0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934
计算得X=12.583
换算后得
A=6.2915ug
F=3
故酶活力为1.2583单位
六．实验分析
误差分析:
试管液体的选取：
保证选用的胰蛋白酶液是新鲜的，有较好的活性和催化效率
尽量保持不同试管溶液配制的时间差达到最小，试管内的溶液不易搁置太久
取液时的操作：
各种容器洗后壁上残留水
移液管洗刷完后没有润洗，导致所移液体不纯
移液管的俯视和仰视使读数不准
从水浴中拿出试管，没有使试管完全冷却。
是测得的分光值可能不准确，是液体的温度尽量相等
分光光度计的正确使用：
1. 分管光度计有锈斑，测量误差较大
2. 在使用分光光度计时，一定要先预热，另外，比色皿要选用透明度好的，有些比色皿由于使用时间过长，或某些原因没有刷干净，颜色发暗，在某些程度上影响了实验结果，在选取时一定要注意。
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca 2+ 的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N 端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3 时最稳定，低于此pH 时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca 2+ 离子对胰蛋白酶有稳定作用。
重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为
底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。
酪素
微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。
酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全，常用于制备培养基。