胰蛋白酶活力测定

实验胰蛋白酶活力测定

一、原理

福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。

蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。

二、实验仪器

试管

7220分光光度计

恒温水浴锅

三、实验试剂

福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml

10%三氯乙酸溶液

0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：

0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再

加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。 500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤

标准曲线的制作：按下表加入试剂：

0.20.40.60.81.0蒸馏水

1.0

0.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液6

54321管号

各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。 以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。 样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂

0 OD6801

1福林试剂B 5.0

5.0 0.55mol/L碳酸钠溶液

37水浴中显色15分钟1

1上清液

过滤3.0

3.0 10%三氯乙酸溶液1.0

0 2mg/ml胰酶溶液0

1.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液

37水浴中酶解15分钟2.0

2.0 0.5%酪素溶液

备注2

1

管号

五、结果计算

酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15 ╳F

A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数

F—酶液稀释倍数

原始数据：（注：7号为待测液）

液体编

号

0 1 2 3 4 5 7

分光光

度计值

0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 分光光

度计值

0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 分光光

度计值

0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934

计算得X=12.583

换算后得

A=6.2915ug

F=3

故酶活力为1.2583单位

六．实验分析

误差分析:

试管液体的选取：

保证选用的胰蛋白酶液是新鲜的，有较好的活性和催化效率

尽量保持不同试管溶液配制的时间差达到最小，试管内的溶液不易搁置太久

取液时的操作：

各种容器洗后壁上残留水

移液管洗刷完后没有润洗，导致所移液体不纯

移液管的俯视和仰视使读数不准

从水浴中拿出试管，没有使试管完全冷却。是测得的分光值可能不准确，是液体的温度尽量相等

分光光度计的正确使用：

1. 分管光度计有锈斑，测量误差较大

2. 在使用分光光度计时，一定要先预热，另外，比色皿要选用透明度好的，有些比色皿由于使用时间过长，或某些原因没有刷干净，颜色发暗，在某些程度上影响了实验结果，在选取时一定要注意。

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca 2+ 的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N 端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3 时最稳定，低于此pH 时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca 2+ 离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为

底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。

酪素

微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。酪蛋白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全，常用于制备培养基。