第九章 标记-1

♦线性DNA模板多处与寡核苷酸引物杂交； ♦ DNA聚合酶I（ Klenow片段）沿单链模板合成dsDNA （5’—3’)；（无5’—3’外切核酸酶活性） ♦并将Dig-11-dUTP掺入DNA。
（2） 切口平移法（nick translation） translation） （
原理： ♦ E.coli DNA聚合酶I具有5’－3’外切核酸酶活性，从切口的 5’端除去核苷酸； ♦ E.coli DNA聚合酶I （5’－3’聚合酶活性）催化下，把核苷 酸残基加在切口的3’－OH端； ♦ 5’端的去除，与3’的加入核苷酸同时进行，切口沿着DNA 模板链移动，Dig-II-dUTP被加入到DNA双链中。
试剂： ♦随机引物：用DNase酶降解小牛胸腺DNA或鲑鱼精DNA，产生的6—
12个核苷酸的ssDNA/或用合成仪合成 ♦ DNA模板： ♦ DNA聚合酶：来自E.coli的DNA聚合酶I大片段（称为Klenow片段） ♦ Dig-11-dUTP：标记物 ♦ dNTP：底物
原理：
♦将待标记的DNA片段变性；
1.1.1 基本概念 探针（probe)：标记\示踪物
1.1.2 探针的种类及选择
（1） 种类：根据核酸探针的来源及性质，分为： 基因组DNA探针 DNA cDNA探针（包括单链DNA探针） cRNA探针（体外转录的cRNA探针） 人工合成的寡核苷酸片断探针：15—30bp
（2） 探针的选择： 原则：要有高度的特异性
引物 随机引物法 切口平移法 PCR法 随机引物 切口处 正链引物 负链引物
酶 Klenow片段 DNaseI E.coliDNA聚合
1）3’端寡核苷酸探针（用Dig－II-ddUTP制备）
在末端转移酶作用下，在3’端加上Dig－II-ddUTP
原理：在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固 相氨基磷酸盐方法，使5’端氨基活化，寡核苷酸 与DIG反应，制成5’端标记的寡核苷酸探针。 标记物：DIG－NHS easter，毒性大
2.1.5 RNA探针的制备
原理：单链RNA探针采用体外转录法制备
步骤：
♦将模板DNA插入到转录载体中（插入到强启动子下游的多 克隆位点），组建重组质粒； ♦用限制性内切酶，酶切外源DNA下游，使质粒线性化； ♦以此为模板，在RNA聚合酶作用下，在强启动子下游固定 位点开始转录，将DIG-UTP掺入至RNA链中。 得到RNA探针（每20－25个核苷酸可结合一个DIG-UTP）
2.1 地高辛标记（digoxigenin,DIG)
可用酶促反应将其掺入DNA或RNA中； 然后用带有碱性磷酸酶（AKP）、过氧化物酶或荧光素的 抗地高辛抗体进行免疫反应； 通过化学呈色或直接在（荧光）显微镜下观察。
2.1.1 双链DNA探针标记
♦随机引物介导法 ♦ ♦切口平移法
1）随机引物介导法
2.3 介绍两种新标记法
2.3.1 扫若仑（psoralen）标记 原理（操作过程）：
1）扫若仑为一种天然三环化合物 2）用320－400nm光射照，引起光循环反应，使带胺基的扫 若仑衍生物的三环平面插入核酸分子，与核酸分子共价连 接。
3）扫若仑衍生物结合于核酸中的胸苷及尿苷，故扫若仑衍 生物含量与核酸中的胸苷或尿苷含量成正比。 4）扫若仑标记为非酶学反应，反应恒定，可标记任何数量 的核酸。 5）扫若仑标上半抗原物质，即为制备好的探针。
原理：在PCR循环过程中，Taq DNA聚合酶（水 生栖热菌，耐热性好，70－75℃，反应活性高） 可将Dig-II-dUTP掺入DNA链中。
PCR技术：
♦聚合酶链式反应（polymerase chain reaction),简称PCR ♦是一种体外快速扩增DNA序列的技术 ♦采用耐热的Taq DNA聚合酶 ♦只需数小时，可成百万倍扩增特定序列
1.1.3理想的标记物具备的条件：
♦灵敏度高； ♦标记物与被标记物结合后，绝对不影响其base配对的特异性； ♦不影响探针分子的主要理化性能，如：解链温度Tm ♦检测方法灵敏度高，假阳性率低； ♦化学稳定性好，制作方便； ♦对环境无污染，对人体无损伤，价格低廉。
第二节 非核素标记
非放射性核素标记常用：生物素、地高辛
♦酶一底物颜色反应检测：亲和素可以用酶（过氧化物酶、碱性磷酸酶
等）、荧光素或高电子密度（铁蛋白，胶体金等）的标志物标记。
2.2.1 切口平移法制备生物素酰化的探针
采用生物素－II-dUTP 1kbDNA 1kbDNA可掺入50个生物素分子 50
2.2.2 随机引物介导制备生物素酰化探针 方法同Dig-11－dUTP Dig-11 dUTP
第九章 标记
几个概念：
1、标记：以共价键的方式将示踪物结合到某些生物 分子上，形成探针的过程。 2、探针（probe）：示踪物与被标记物构成的复合 物。 探针已成为分子生物学的常用技术，在序列测定、 分子杂交、免疫分析等方面有广泛应用。
3、示踪物：
♦放射性同位素（核素）：3H、14C、32P、35S、125I
2.1.2 单链DNA探针的制备
单链DNA探针不存在互补双链，避免了双链复性时形成的无 效杂合体。
1）将DNA模板重组克隆于M13噬菌体上，合成与其序列互 补的探针 原理（过程）：
♦人工合成的寡核苷酸引物与M13噬菌体上的DNA模板杂交； ♦以E.coli DNA聚合酶I的klenow片断合成带标记的DNA探针。
♦非放射性物质（非核素）：地高辛、生物素等
本章提要
核酸探针简介 非核素标记 核素标记 探针的纯化 探针的鉴定 蛋白质（酶、抗体）标记
第一节 核酸探针简介
核酸探针：是指能与特定核酸序列（靶序列）发 生特异性互补（核酸杂交），并含示踪物的已知 核酸片断（DNA/RNA）。
1.1 核酸探针的基本概念和种类
2.3.2 分子灯塔探针（biological beacon）
原理：
1）分子灯塔探针：由25个核苷酸组成 2) 3’－端为5个NTP与5’－端为5个NTP为互补序列。在室温 下，熄灭剂与发光剂紧密结合，使荧光基团处于熄灭状态， 不产生荧光。 3）当灯塔探针中的15个NTP与靶DNA杂交时，发光剂与熄 灭剂分开，产生荧光。
2）3’－端尾部寡核苷酸探针
5’－－－ + DIG-dUTP + 末端转移酶 ＋ dNTP 5’－－－ ♦ ♦ ♦ 原理： ♦在寡核苷酸3’－端加上10～100个碱基的尾巴。 ♦在标记过程中，末端转移酶将DIG-II-dUTP加在3’－尾部 ♦其灵敏度比3’端－寡核苷酸探针高10倍以上
3） 5’－端寡核苷酸探针
2.2 生物素标记 （biotin）
原理： ♦链霉菌白旦白（链霉菌亲和素），有4个生物素结合位点，既可与探针
中的生物素结合，又可与酶标记的生物素（如：碱性磷酸酶）结合。
♦将生物素（Biotin）连接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高
亲和力的原理，分子杂交后用链霉亲和素（Streptavidin）进行检测。
试剂： ♦寡核苷酸引物 ♦ E.coli DNA聚合酶I的klenow片断 ♦ Dig-11-dUTP： ♦ dNTP
2） 用反转录酶将mRNA反转录为cDNA（互补DNA）
要加RNase抑制剂，避免RNA酶的污染； AMV反转录酶：来自鸟类或成髓细胞白血病病毒
2.1.3 PCR法合成DNA探针