肿瘤细胞培养和杂交瘤技术医学
杂交瘤技术流程
杂交瘤技术流程引言：杂交瘤技术是一种重要的细胞和分子生物学研究方法，可以用于合成抗体、研究蛋白质功能以及筛选抗肿瘤药物等领域。
本文将介绍杂交瘤技术的流程，包括细胞融合、筛选和鉴定杂交瘤等环节。
一、细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的第一步，旨在将抗体产生细胞与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
具体步骤如下：1.1 收集抗体产生细胞和肿瘤细胞：抗体产生细胞可以来自小鼠或人类免疫系统，而肿瘤细胞则常使用骨髓瘤细胞等。
1.2 调整细胞浓度：将抗体产生细胞和肿瘤细胞分别离心，去除培养基，然后重新悬浮在含有多种营养物质的培养基中，使其浓度适宜。
1.3 细胞融合：将抗体产生细胞和肿瘤细胞按照一定比例混合，加入聚乙二醇等融合剂，使细胞融合。
1.4 培养杂交细胞：将融合后的细胞放入含有适宜培养基的培养皿中，利用恒温培养箱进行培养，以促使杂交细胞的生长和繁殖。
二、筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞是为了从大量的融合细胞中筛选出能够产生特定抗体的杂交瘤细胞。
具体步骤如下：2.1 选择培养基：准备含有适宜培养条件的培养基，其中可能包含抗生素等物质以抑制非杂交细胞的生长。
2.2 稀释细胞：将培养皿中的杂交细胞适当稀释，使其分散在培养基中。
2.3 培养杂交细胞：将稀释后的杂交细胞转移到含有适宜培养基的培养皿中，继续在恒温培养箱中培养。
2.4 筛选条件：根据所需抗体的特性，设置相应的筛选条件，如添加特定抗原、采用酶联免疫吸附实验等。
2.5 筛选结果：通过观察培养皿中细胞的形态、颜色等特征，确定是否产生了目标抗体的杂交瘤细胞。
三、鉴定杂交瘤细胞鉴定杂交瘤细胞是为了确认所筛选出的细胞确实具有产生特定抗体的能力，并且可以稳定地传代。
具体步骤如下：3.1 克隆化：将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化，即分离成单个细胞，并分别培养在不同培养皿中。
3.2 培养单克隆细胞：将克隆化后的单克隆细胞继续在恒温培养箱中培养，观察细胞生长情况，筛选出生长良好的细胞。
杂交瘤技术(hybridoma technique)基本程序与方法 6
杂交瘤技术（hybridoma technique）基本程序与方法 6（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的 -5℃?0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。
另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
肿瘤细胞培养技术
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
肿瘤细胞的培养
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率
作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体
肿瘤细胞培养的应用
肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑 癌基因的分析、染色体定位（FISH法）
肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期 （FACS)、信号传递
肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免 疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧 光免疫、放射免疫、免疫印迹）
建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电 镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、 致瘤及转移情况
注意：不是每一肿瘤组织都能建株
应用- 肿瘤治疗的研究
治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
增生、吞噬碎片；第4~5天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后5~7天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml ~ 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。
单克隆抗体制备
七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状
态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。
可溶性抗原：2~10g
细胞抗原：1 105
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
杂交瘤技术的实验原理
融合方法
通过物理或化学方法诱导 细胞融合，如电融合、聚 乙二醇等。
融合率
确保高融合率，以获得足 够数量的杂交瘤细胞。
抗体生成原理
通过筛选获得高亲和力的 特异性抗体。
产生的抗体可以是IgG、 IgM等不同类别。
杂交瘤细胞在适宜的条件 下产生特异性抗体。
抗体产生
抗体亲和力 抗体类别
抗体筛选原理
筛选方法
生物标志物发现
利用杂交瘤技术可以发现新的生物标志物，有助于深入了解生物学过程和疾病 发病机制。
THANK YOU
05
杂交瘤技术的应用前景与展望
杂交瘤技术在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤标志物检测
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤标志物的检测，有助于肿瘤的早期发现和诊断。
免疫治疗
杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以用于肿瘤的免疫治疗，通过与免疫细胞结合，激活免疫系统对肿瘤细胞的攻击。
杂交瘤技术在疫苗研发中的应用
1980年代
1990年代至今
随着基因工程技术的发展，出现了多 种改进的杂交瘤技术，如基因敲除、 转基因动物模型等，进一步拓展了杂 交瘤技术的应用范围。
杂交瘤技术开始应用于临床诊断和生 物治疗领域，成为单克隆抗体产业化 的基础。
02
杂交瘤技术的实验原理
细胞融合原理
01
02
03
细胞融合
将免疫细胞与肿瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤技术的实验原理
目 录
• 杂交瘤技术概述 • 杂交瘤技术的实验原理 • 杂交瘤技术的实验步骤 • 杂交瘤技术的优缺点 • 杂交瘤技术的应用前景与展望
01
杂交瘤技术概述
定义与特点
定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B细 胞和骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞的技术。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是一种常用的遗传学实验方法，用于研究基因的功能和调控。
其基本原理是将两个不同品系或物种的细胞或组织相互融合，生成杂交细胞或杂交瘤。
这些杂交细胞或瘤细胞会融合两个品系或物种的基因信息，同时保留着两个母细胞的细胞器和细胞质基因。
杂交瘤技术的基本步骤如下：
1.选择母细胞：选择具有所需特性的两个不同来源的细胞或组织作为杂交的母细胞。
一般选择一个无能力生长但含有所需基因的细胞（称为donor细胞）和一个能够快速增殖但缺乏所需基因的细胞（称为host细胞）。
2.处理细胞：将两个细胞进行特定处理，使其融合在一起。
一种常用的方法是使用化学物质（如聚乙二醇）或电脉冲来增加细胞融合的效率。
3.筛选和培养：将融合后的细胞进行筛选，通常是通过添加相应抗生素或培养基来筛选并培养合适的杂交细胞或杂交瘤。
4.分离纯化：通过稀释法或细胞克隆等方法，将杂交瘤细胞分离并纯化，以获得纯的杂交细胞系或杂交瘤。
杂交瘤技术的应用非常广泛，主要用于以下方面：
1.产生单克隆抗体：通过杂交瘤技术，可以融合具有所需抗体的B细胞与快速增殖的癌细胞，得到能够大规模产生特定抗体的杂交瘤细胞系。
2.研究基因功能：将疾病相关的基因或调控元件与高增殖性的癌细胞融合，可以研究相关基因的功能及其在疾病中的作用机制。
3.生产重组蛋白：将所需基因与杂交瘤细胞融合，可以实现大规模生产特定蛋白质，并用于医药和生物工程领域。
总之，杂交瘤技术是一种有效的遗传学实验方法，通过细胞融合的方式结合两种细胞的特性，用于研究基因功能、产生单克隆抗体和生产重组蛋白等多个领域。
医学检验技术：杂交瘤技术的基本原理
医学检验技术：杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是事业单位考试免疫学检验的一个重要的部分，大家对于杂交瘤技术比较熟悉可能还是因为在高中的生物大家就有接触过这一部分，学起来也不那么吃力了。
杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
技术本身包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
(一)小鼠骨髓瘤细胞
细胞株稳定，易于传代培养
细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子
该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶(HGPRT)的缺陷株
(二)免疫脾细胞
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫
(三)细胞融合
PEG(聚乙二醇)可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。
(四)杂交瘤细胞的选择性培养
HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷
1.脾细胞(指B细胞)在一般培养基中不能生长繁殖
2.骨髓瘤细胞
因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡
3.杂交瘤细胞
由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞
由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。
因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来。
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理
1.融合：将癌细胞和免疫细胞以一定的比例混合，并经过刺激，使其融合成杂交瘤细胞。
刺激方法可以采用化学物质（如聚乙二醇）或电脉冲等。
2.杂交瘤细胞培养：将融合后的细胞在含有足够营养物质的培养基中进行培养。
由于杂交瘤细胞一般具有对培养条件要求较高且很容易生长，所以培养基的选择和培养方式等需要进行优化。
3.筛选：为了筛选出能够分泌目标抗体的杂交瘤细胞，常会进行抗体的检测。
最常用的方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），将培养液中的抗体与特异抗原结合，然后用酶标记的二抗结合，通过酶作用的颜色反应来检测抗体的存在。
4.单克隆化：通常通过稀释法将筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆化。
即将细胞进行限稀化，使得每个培养皿上只有一个细胞。
然后扩大单个细胞的培养，并进行抗体检测和细胞鉴定，最终得到稳定的分泌目标抗体的单克隆细胞株。
杂交瘤细胞筛选的原理基于杂交瘤细胞的特性，由于是细胞的融合，杂交瘤细胞可以同时继承两种源细胞的特性。
癌细胞提供了高增殖能力，可以快速扩大细胞数目，从而提高抗体的生产能力；而免疫细胞提供了抗体的生产能力。
通过对杂交瘤细胞的筛选，可以选择出分泌高水平目标抗体的细胞株，从而用于大规模生产特定抗体。
总之，杂交瘤细胞筛选是一种利用细胞融合技术筛选特定细胞株的方法。
通过融合癌细胞和免疫细胞形成杂交瘤细胞，再通过抗体检测的方式筛选出特定抗体分泌细胞，最终可以得到稳定的杂交瘤细胞株。
这种技术
在生物医学和制药领域中具有广泛的应用前景，可以用于生产高效、稳定的蛋白质和抗体等重组产物。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要制备步骤
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。
它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
b淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理
b淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理
淋巴细胞杂交瘤技术（又称克隆淋巴细胞杂交瘤技术）是一种
用于生产单克隆抗体的方法。
其基本原理是将小鼠淋巴细胞与骨髓
瘤细胞（如NS-1细胞）融合，形成杂交瘤细胞，这些细胞称为淋巴
细胞杂交瘤细胞或克隆细胞。
这些细胞具有淋巴细胞的抗原识别能
力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，从而能够持续产生具有特定抗原
识别能力的单克隆抗体。
具体步骤包括：
1. 选择合适的小鼠作为抗原免疫动物，注射目标抗原以激发其
免疫系统产生抗体。
2. 从小鼠体内获得淋巴细胞，这些细胞含有已经产生的抗体基因。
3. 从骨髓瘤细胞中获得无限增殖能力的细胞系，如NS-1细胞。
4. 将淋巴细胞和骨髓瘤细胞以特定比例混合，通过化学或电脉
冲的方法使它们融合成杂交瘤细胞。
5. 将融合后的细胞在含有特定筛选标记的培养基中培养，以去除未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞。
6. 对杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养，使其形成单克隆细胞系。
7. 测定单克隆细胞系产生的抗体，筛选出特异性抗原的单克隆抗体细胞系。
淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理是利用细胞融合的方法将抗原识别能力和无限增殖能力相结合，从而获得能够持续产生特定单克隆抗体的细胞系。
这一技术在生物医学研究和生物制药领域具有重要应用，可以生产大量高质量的单克隆抗体，用于治疗、诊断和研究等方面。
杂交瘤技术
杂交瘤技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备目前，在世界上，已建立起数以千计的具有各种特异性的单克隆杂交瘤细胞系，它们所产生的单克隆抗体，在许多领域得到广泛应用。
1单克隆抗体在诊断上的应用单克隆抗体可辨认抗原物质结构的微细差异，并和抗原发生特异性结合，用放射免疫法能精确地测定抗原物质在体内的含量及变化。
对某些常见病、传染病、寄生虫病、肿瘤及体内激素或酶的缺陷症，做出快速而正确地判断。
希伯(Hbure)等用放射性同位素标记的单克隆抗体追踪心肌组织肌球蛋白的变化，拍摄了心肌损伤部位的可见图象。
目前已研制出能鉴定麻疹病毒、狂犬病毒、牛腹泻病毒、马流产病毒马传染性贫血病毒、牛鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒等的单克隆抗体。
用放射性同位素标记的抗癌细胞单克隆抗体，在体内和癌细胞发生特异性结合，可发现用常规方法不能探测出的微小肿瘤的存在及其位置。
2单克隆抗体在治疗上的应用给患病的机体注射一定剂量的特异性单克抗体能增强机体对该病的抵抗力弗里曼隆(Freeman)等用含有抗疟原虫单克隆抗体的小鼠血清,注射给已感染疟原虫的小鼠，使病鼠的死亡率下降。
已研制出抗人恶性疟原虫单克隆抗体。
此外单克隆抗体还有解毒和脱敏作用，这是由于它能和血中的过量药物发生中和作用或与药物的受体部位相结合产生竞争性抑制的结果。
单克隆抗体对癌症的治疗，可做出重大贡献。
当抗癌细胞的单克隆抗体与大剂量的放射性化合物或细胞毒剂相偶联后，注人体内再同癌细胞结合就能在原位把癌细胞致死人们把这种新疗法叫做癌症的导弹疗法。
所用的细胞毒剂包括抗癌药物—氨甲喋吟、苯丁酸氮芥等，毒素—白喉毒素、蓖麻毒素蛋白等。
米勒(miller)等人用这种疗法治疗白血病和淋巴瘤时得到了满意的效果。
单克隆抗体对过去无法治疗的“严重混合免疫缺陷症”有特效。
哈佛医学院莱因赫茨(Reinehrz)等成功地用多种单克隆抗体治疗这种病的患者。
此外单克隆抗体还是一种很有应用前景的免疫抑制剂。
比泊(Bieber)等人建立了能生产抗胸腺细胞的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，做异体植皮试验时，给实验猴注射这种单克隆抗体使异体皮的存活期延长十夭。
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法杂交瘤细胞培养是指将哺乳动物体内的B细胞与合成瘤细胞进行细胞融合，产生一种能分泌出单一抗体的细胞系。
这种细胞系称为杂交瘤细胞，也称混合瘤细胞。
杂交瘤细胞不仅具有母细胞的一般生存特性和原有的基因表达，而且能大量分泌相同的单克隆抗体，是生物医学研究、药物研发和临床治疗领域的重要工具。
本文将详细介绍杂交瘤细胞培养的方法。
1.材料准备制备细胞培养基：DMEM/F12培养基（10%胎牛血清）加入生长因子（如IL-6、IL-21）；细胞培养器具：细胞培养箱、培养瓶、移液器、离心机、细胞计数器等；试剂：1X PBS、0.25%胰酶-EDTA、细胞培养级聚乙二醇、多克隆抗体、血清和其他生长因子。
2.细胞分离和融合将B细胞和合成瘤细胞按照比例混合，然后使用聚乙二醇催化剂将两种细胞融合。
融合后的细胞称为杂交瘤细胞。
需要注意的是，不同的瘤细胞和B细胞的比例会影响融合后杂交瘤细胞的数量，因此需根据实验的需要控制比例。
3.细胞培养将融合后的细胞培养在含有生长因子和10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，并将其放置在细胞培养箱中，培养温度为37°C。
3-4天后，将细胞连续传代至新的培养瓶中，以支持细胞的生长和增殖。
连续传代可提高细胞的生产力和稳定性。
4.单克隆抗体筛选将多克隆抗体加入培养基中，将其暴露于培养基中数天，收集上清液，然后通过ELISA或Western Blot等技术来鉴定上清液中抗体的特异性和亚型。
在经过多次分离和筛选后，最终选出单一克隆抗体的杂交瘤细胞。
5.维护细胞在进行杂交瘤细胞的维护过程中，需注意以下几点：（1）定期更换培养基和加入新的生长因子、抗生素和胎牛血清。
（2）避免细胞密度过高和过低，应保持适当的细胞密度。
（3）定期检测细胞的生活力和纯度。
（4）不同的杂交瘤细胞需要不同的培养条件和处理方法，应针对不同的杂交瘤细胞选择适当的培养方法。
综上所述，杂交瘤细胞培养是一种基于细胞融合技术制备单克隆抗体的有效方法。
杂交瘤技术的原理和应用
杂交瘤技术的原理和应用1. 原理杂交瘤技术（Hybridoma Technology）是一种利用小鼠骨髓细胞与肿瘤细胞融合的方法，成功制备出可以长时间稳定产生单克隆抗体的细胞系。
其原理主要包括以下几个步骤：1.免疫反应：首先，将目标抗原注射到小鼠体内，刺激小鼠产生特定抗体。
2.提取骨髓细胞：将小鼠的骨髓细胞提取出来，骨髓细胞中含有大量产生抗体的浆细胞。
3.融合：将提取的骨髓细胞与骨髓瘤细胞（如懒汉肉瘤细胞）进行融合，得到杂交细胞。
4.筛选：将杂交细胞进行筛选，通过培养基和细胞培养条件的优化，筛选出可以长期产生抗体的稳定细胞系。
2. 应用杂交瘤技术在生物医药领域具有广泛的应用价值，主要集中在以下几个方面：2.1 产生单克隆抗体杂交瘤技术可以制备出可以长期稳定产生单克隆抗体的细胞系，这对于研究和应用单克隆抗体具有重要意义。
单克隆抗体在临床诊断、治疗和疾病标记等方面有着广泛的应用，例如，可用于检测特定疾病标志物、治疗癌症等。
2.2 研究蛋白质结构与功能由杂交瘤技术获得的单克隆抗体可以应用于免疫印迹、免疫组化等实验方法，用于研究蛋白质的表达、定位、结构和功能。
通过分析抗体与靶蛋白的相互作用，可以揭示蛋白质在生物体内的生理功能和生物学机制。
2.3 生物学药物和诊断试剂的生产杂交瘤技术可以用于生物学药物的生产，例如单克隆抗体药物、重组蛋白药物等。
杂交瘤技术还可以制备用于临床诊断和检测的试剂盒，用于检测特定疾病的标志物、病原体等。
2.4 分子免疫学研究杂交瘤技术在分子免疫学研究中具有重要地位。
通过制备获得的单克隆抗体，可以对特定的抗原进行精确定位，研究免疫应答的机制、免疫调控等。
杂交瘤技术也被广泛应用于抗体工程、抗体片段构建等技术的开发与应用。
2.5 其他应用领域此外，杂交瘤技术还在农业、环境保护、食品安全等领域有所应用。
例如，可以应用于农业植物抗性基因的研究与育种、环境中有毒物质的检测与分析等。
结论杂交瘤技术作为一种重要的细胞融合技术，在生物医药领域具有广泛的应用前景。
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是一种重要的生物技术手段，它在农业、医学和科
学研究领域都有着广泛的应用。
其基本原理是利用不同种属的细胞
融合形成杂交细胞，从而获得具有两种细胞特性的细胞，进而产生
新的生物体。
下面将就杂交瘤技术的基本原理进行详细介绍。
首先，杂交瘤技术的基本原理是细胞融合。
细胞融合是指来自
不同个体的细胞融合在一起，形成一个细胞。
在杂交瘤技术中，通
常采用多种方法来实现细胞融合，比如化学诱导、电脉冲、病毒介
导等。
这些方法可以使细胞膜破裂，从而促使不同细胞的质膜融合，形成杂交细胞。
其次，杂交瘤技术的基本原理是杂交细胞的融合。
杂交细胞是
指来自不同种属的细胞融合在一起，形成一个细胞。
这种细胞融合后，会产生新的细胞核和细胞质，从而形成具有两种细胞特性的细胞。
这些细胞可以继续分裂，形成新的生物体，这就是杂交瘤技术
的基本原理。
最后，杂交瘤技术的基本原理是产生杂交瘤。
杂交瘤是指由杂
交细胞产生的肿瘤。
这种肿瘤具有两种细胞的特性，可以继续分裂，
形成新的生物体。
杂交瘤技术可以通过对杂交细胞进行培养和筛选，最终产生具有所需特性的杂交瘤，从而实现对目标特性的控制和利用。
综上所述，杂交瘤技术的基本原理是通过细胞融合形成杂交细胞，进而产生具有两种细胞特性的细胞，最终产生杂交瘤。
这种技
术在农业、医学和科学研究领域有着广泛的应用，可以用来改良作物、研究疾病机制、生产药物等。
因此，深入理解杂交瘤技术的基
本原理对于推动生物技术的发展具有重要意义。
杂交瘤细胞技术原理
杂交瘤细胞技术原理你知道吗？在科学的奇妙世界里，有一种超级厉害的技术叫杂交瘤细胞技术，今天咱们就来唠唠它的原理。
咱们先得从身体里的细胞说起。
就好比我们的身体是一个超级大的社区，细胞呢，就是这个社区里的小居民。
身体里有两种很重要的小居民，一种是免疫细胞，它们就像社区里的保安，到处巡逻，保护我们的身体不被外来的坏蛋入侵；另一种是癌细胞，这可是坏居民，它们不听指挥，疯狂地分裂繁殖，就像社区里的小混混到处捣乱。
现在我们要把这两种细胞拉到一起搞点事情。
不过，这俩细胞就像水火不容的冤家，正常情况下根本不会合作。
科学家们就想出了一个超级聪明的办法。
首先呢，要给免疫细胞来点刺激，让它们变得活跃起来。
这就好比给保安们打打气，让他们提高警惕。
然后把这些被刺激的免疫细胞和癌细胞放在一起。
这时候就像是把保安和小混混关到了一个小房间里。
接下来神奇的事情就发生了。
在一种特殊的化学物质的帮助下，它们会发生融合。
这个过程就像是给保安和小混混施了魔法，让他们合为一体。
这个融合后的细胞就是杂交瘤细胞啦。
这个杂交瘤细胞可不得了，它既有免疫细胞识别坏蛋的能力，又有癌细胞疯狂分裂的本事。
我们再来说说具体的数字比例。
其实在融合的过程中，并不是每一个细胞都能成功融合的。
就像你把一堆珠子混合在一起，只有一部分珠子会按照你想要的方式组合起来。
在这个过程中，可能只有一小部分细胞能变成杂交瘤细胞，比如说只有千分之一或者万分之一的细胞能成功融合。
这些杂交瘤细胞产生以后，我们还得把它们筛选出来。
怎么筛选呢？这就像是在一堆混合的豆子里，把我们想要的特殊豆子挑出来一样。
科学家们会利用杂交瘤细胞和其他细胞不同的特性，用特殊的培养基来培养它们。
在这个培养基里，只有杂交瘤细胞能够茁壮成长，其他没融合的细胞或者融合失败的细胞就长不好啦。
这个杂交瘤细胞技术有什么用呢？它可以用来生产单克隆抗体。
单克隆抗体就像是精准的小导弹，可以专门找到身体里的某种特定的坏蛋，比如说某种病毒或者细菌，然后把它们消灭掉。
杂交瘤抗体技术的基本原理
杂交瘤抗体技术的基本原理杂交瘤抗体技术（Hybridoma technology）是一种重要的细胞生物学技术，用于在体外大量生产单克隆抗体。
该技术的基本原理是通过将具有特异抗原识别能力的B淋巴细胞与癌细胞（骨髓瘤细胞）融合成杂交瘤细胞，从而获得既具有B 淋巴细胞的特异抗原识别能力，又具有癌细胞的无限增殖能力的混合细胞。
通过培养这些杂交瘤细胞，可以获取大量生产特异性单克隆抗体的能力。
具体来说，杂交瘤抗体技术主要包括以下几个步骤：原生抗原免疫、细胞融合、筛选和克隆化。
首先，需要用原生抗原对小鼠（或其他合适的动物）进行免疫。
免疫过程中，将原生抗原注入小鼠体内，使得小鼠的免疫系统产生特异性抗体。
原生抗原可以是具有特定抗原性的蛋白质、多肽、多糖或其他小分子。
接下来，需要采集小鼠的脾脏细胞，其中包括B淋巴细胞。
这些细胞是体内产生抗体的主要细胞类型。
然后，将获得的小鼠脾脏细胞与特定的癌细胞（骨髓瘤细胞）进行融合。
癌细胞具有高度增殖能力，但是缺乏自身产生抗体的功能。
通过融合，可将两者的优势结合起来，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的关键步骤是融合剂的添加，常用的融合剂包括聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）或电融合等方法。
融合后的细胞经过培养，形成杂交瘤细胞系或克隆。
接下来，需要进行对杂交瘤细胞的筛选。
杂交瘤细胞融合后，细胞状态杂乱，包括混合细胞和单个细胞。
为了筛选出合适的杂交瘤细胞，通常会采用HAT选择培养基。
HAT选择培养基含有嘌呤、嘧啶和大环酸（aminopterin）。
此种培养基筛选基于杂交瘤细胞同时需要三种成分合成DNA和RNA，但正常骨髓细胞无法合成这些成分，从而导致正常骨髓细胞死亡，只有杂交瘤细胞可以生存和增殖。
经过适当的筛选，能够获得产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
杂交瘤细胞系具有很强的生长和增殖能力，同时也保留了母细胞所特有的特异性抗原识别能力。
在杂交瘤细胞系的培养中，需要采用适当的培养基和条件来维持细胞的稳定生长和抗体的产生。
杂交瘤技术在生物医学中的应用
杂交瘤技术在生物医学中的应用在生物医学研究领域中，杂交瘤技术可以说是一种重要的实验手段。
自从1960年代开始，这种技术被广泛应用于癌症、免疫学、神经科学、遗传学等领域。
通过培养杂交瘤，人们可以获得多种特定的抗体、激素、酶等分子，这些分子不仅可以被用于诊断和治疗疾病，还可以深度探究生命科学的各个方面。
一、什么是杂交瘤？杂交瘤是一种由癌细胞和免疫细胞的”融合“所产生的细胞群，它拥有免疫细胞产生的抗体分子和癌细胞的快速增殖能力。
克隆化的杂交瘤能够无限制地不断产生单克隆种子，使得人们可以在实验条件下生产出大量特定的分子。
为了制备杂交瘤，一般需要将骨髓细胞或淋巴细胞等免疫细胞与癌细胞进行融合，得到的细胞称为杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞拥有从免疫细胞中获得的抗体抗原受体和从癌瘤细胞中获得的快速增殖特性，从而能够长期产生高水平的抗体等分子。
二、杂交瘤技术的应用1.癌症研究癌症是目前人类健康面临的主要问题之一。
应用杂交瘤技术，人们可以制备大量的特异性抗体，用于检测肿瘤标志物、研究癌细胞的生物学特性、筛选分子靶点等。
除此之外，杂交瘤技术还可以用于检测肿瘤细胞表面的抗原，通过对来自不同患者的癌瘤细胞进行克隆化和筛选，发现不同肿瘤的抗原异质性，为临床肿瘤治疗提供了新的思路和策略。
2.免疫学研究免疫系统是人体对外界细菌、病毒等侵袭的主要防御工具，应用杂交瘤技术，可以制备大量的特异性抗体和细胞因子，用于深入研究免疫细胞的功能和作用机制。
例如，人们可以运用杂交瘤技术，来制备抗体，以了解人体对不同化学物质、药物、细胞表面分子等的免疫反应。
此外，杂交瘤技术还可应用于制备巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞等各种细胞系，用于研究同种异体移植、变态反应等问题。
3.神经科学研究神经系统是人体最为重要、最为复杂的系统之一，应用杂交瘤技术可以制备大量的特定神经元和神经前体细胞，并用于神经发生、功能组装及信号传导等方面的研究。
例如，学者通过将神经元与免疫细胞进行杂交，制备出可以产生可自发性放电的细胞系，从而研究神经学疾病的发病机理和治疗手段。
杂交瘤细胞的检测原理
杂交瘤细胞的检测原理
杂交瘤细胞是一种特殊的细胞，它具有高度的增殖能力和稳定的基因表达。
杂交瘤细胞的产生是通过将体外培养的B细胞与肿瘤细胞融合而得到的。
这种融合细胞不仅能够保持B细胞的抗体合成能力，还能够具有肿瘤细胞的无限增殖能力，因此被广泛应用于抗体和蛋白质表达的研究中。
杂交瘤细胞的检测原理通常是通过对其产生的抗体进行检测。
因为杂交瘤细胞能够合成特定的抗体，所以通过检测抗体的存在来确定杂交瘤细胞是否存在。
检测抗体的方法包括ELISA、Western blot、免疫荧光等。
其中，ELISA是最常用的方法之一，其原理是将待测样品加入到预先包被抗原的孔中，如果有抗体存在，则抗体会与抗原结合，利用酶标记的二抗或蛋白A/G进行检测，从而确定抗体的存在。
除了检测抗体外，还可以通过检测杂交瘤细胞中的特定基因来确定其存在。
这种方法需要对特定基因进行PCR扩增，并对扩增产物进行分析，如果扩增出目标基因，则可以确定杂交瘤细胞的存在。
但是这种方法需要事先了解目标基因的序列，并且需要对扩增产物进行测序，因此在实践中应用较少。
总之，杂交瘤细胞的检测原理主要是通过检测其产生的特异性抗体来确定其存在。
通过合理选择检测方法，可以快速、准确地进行杂交瘤细胞的检测。
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体内细胞处于不同状态，大概分成三种命运: ① 中 骨继不髓同干续时细增期胞殖（，细胃S胞、肠，G上不2皮断、M中离）的开完基G成1底期细细通胞胞过分等细裂，胞，周如期
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癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因
素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、 基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP 和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后 者为相反）。
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正常细胞周期的G1期有一个特殊的调节点—R 点，在生长条件不适宜情况下，细胞不能通过 调节点而不增殖，细胞通过G1期进入M期前受 一种不稳定蛋白质调节通过R点启动DNA的合 成，例如抑癌基因P53最重要的生物学功能就
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肿瘤和正常的组织同样在体内也具有三 种不同的细胞群：
①增殖细胞群（A）：是肿瘤中处于增殖周期的细 胞，与肿瘤生长直接有关，亦是化学疗法最易攻击 的部分。
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②暂不增殖细胞群（B），它是延长了G1 细胞或G0细胞，目前不参加细胞周期， 与肿瘤的扩大暂时无关，由于它保留着 增殖的能力，在一定条件下成为肿瘤复 发根源。
重量时足以致病人于死亡。经治疗后如细胞数 从1012减少至1010，重约10g时可称显效或部 分缓解；若肿瘤细胞数减少到108或106，重约 100mg至10mg时，可认为临床治愈或完全缓
解，但仍有可能复发。要根治肿瘤细胞，必须
彻底消灭所有癌细胞。外科手术切除大量肿瘤 细胞，但转移癌细胞仍有复发的危险。
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当前较有前景的靶向治疗
①现在发展的基因工程腺病毒（ONYX015）因删除了E1B 55KD蛋白而可以选 择性的溶解P53突变或缺失的肿瘤细胞， 此类肿瘤细胞占50℅，也就是腺病毒 ONYX-015可达到50℅的靶向治疗药物的 效果，目前已在头颈部肿瘤中进行Ⅱ期 临床试验。
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安徽医科大学微生物学教研室 龚蕴贞
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大纲
一、肿瘤细胞体外培养的重要性 二、癌细胞系的建立 三、转化细胞系建立 四、癌细胞系和转化细胞系注意事项 五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定 六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的 小结及讨论
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一、肿瘤细胞体外培养的重要性
恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括癌 细胞系和转化细胞系。转化细胞系可以 是恶性转化细胞和一般转化细胞两种。
②不增殖细胞，这类细胞在分裂完成后，暂处 于 分G裂1期期，，如正肝常细情胞况，下只不有合受成损DN或A切，除不时进肝入细细胞胞 再分裂增殖。哺乳动物的初级卵细胞也属于此 类。 ③不增殖细胞，这类细胞由R点走向分化细胞， 并执行专门功能的细胞（称终末细胞）如神经 细胞、哺乳动物成熟的红细胞、皮肤上皮的角 质细胞、多性核粒细胞。
体内或体外一样具有无控制生长和分化不全
的特点，因此比正常细胞容易培养建细胞系。 如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的Hela 细胞系。
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癌细胞的增殖是按指数方式生长的，自一个癌 细胞增殖到能触及的程度要经过30代（109， 1cm3, 1g）。这样1cm3大小的肿块再经过10 代（ 1012 ，10 cm3，1Kg）。这样的大小和
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放线菌素D作用于G1期抑制DNA聚合酶 合成，作用于S后期与G2期抑制rRNA并 影响cAMP水平。放线菌素D不影响非分 裂期细胞，因而放线菌素D是一种细胞周 期特异性药物。
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阿糖胞嘧啶，选择性地抑制核苷二磷酸 还原酶，阻断核苷酸变为脱氧核苷酸， 从而抑制DNA合成，是DAN合成抑制剂， 属于S期特异性药物。
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③不再增殖群（C），它不再参与细胞周
期，而日趋衰老，死亡，对肿瘤增长无 意义。肿瘤的增长情况取决于3种细胞群 的比例，肿瘤增殖率（growth factor GF） 可由下列关系来决定： GF=A／A+B+C。 A群细胞越多， B、C群细胞越少，肿瘤 恶性程度越高。
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常应用体外肿瘤细胞培养，模拟体内环境或确定 单因素多因素研究肿瘤细胞发生发展结局。观察 抗癌药物对细胞周期作用点的影响也常应用肿瘤 细胞体外培养。若能确定肿瘤细胞各周期时间， 选择各期针对性药物进行治疗，则可以提高疗效。
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恶性转化细胞系和癌细胞系一样具有永 久性生长能力和恶性表型，对此二种来 源的细胞系鉴定也是相似的，为研究恶 性肿瘤提供了有用模型。而一般转化细 胞系只具有无限生长能力，不具有恶性 细胞的表型，此种细胞系可相似于正常 细胞的模型而被应用。
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癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在
当前较有前景的靶向治疗
肿瘤对化疗和放疗抗性的一种机制是由 于P53突变或P53的缺失，人类癌50 % P53 突变
Non small cell lung
60 %
Colon
50 %
Breast
40 %
Head and neck
60 %
Ovarian
60 %
医学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱpt
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②制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子 EGF受体EGFR和HER-2。80年代研究人员发现，
在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中 EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员 于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，
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秋水仙素能与微管蛋白强烈结合，引起 微管解体，纺锤体破坏，结果染色体的 移动被阻断，细胞分裂停留在中期，它 是属于M期的特异性药物。
通过体外细胞培养观察抗癌药物对细胞 周期作用点将常用的抗癌药物的细胞周 期分类。
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数十年来医生们除用手术外只能用放疗 和化学疗法来治疗癌症，这些疗法毫无 分别地同时杀死健康细胞和癌细胞，直 到人类基因组图谱的解密，我们才迎来 了适用少数病人的靶向性治疗新时代， 医生们首先分析病人肿瘤中的DNA（基 因），再开出靶向性复合药物的药方， 专门攻击肿瘤细胞发生缺陷的基因，达 到治疗癌症的目的。