生化实验设计1

实验设计：酶偶联反应测定血清中的肌酐

张燕111004048 周方111004052 周跃慧111004053

一、广泛查阅文献、确定候选方法：经过查阅相关文献，根据方法选择的要求对各种方法进行比较，充分了解各方法的科学依据和真实的使用价值，再根据临床应用价值、实验室条件等综合分析后，目前主要的肌酐测定方法有化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法、高效液相层析法、拉曼散射法、同位素稀释质谱法、毛细管电泳法及电极法等。

二、候选方法设计：

1、实验原理：肌酐经肌酐水合酶催化生成肌酸，肌酸与肌酸激酶、丙酮酸激酶、乳

酸脱氢酶的级联催化作用下生成乳酸，并将NADH变成NAD+，测量在340nm处

监测NADH吸光度变化速率，其降低程度与肌酐含量呈正比例，反应式如下

P教材198

2、反应最适条件探讨：设计一系列实验分别探讨该候选方法的最适试剂浓

度、缓冲体系的种类、离子强度、pH值、反应温度和时间、检测波长等。

3、候选方法的初步试验：——对候选方法做初步评价试验，包括：

①标准曲线和重复性；

②质控血清和新鲜标本的重复试验；

③分析浓度不同的标本，并与公认的参考方法的结果对比。

三、方法学评价：

（一）重复性试验：检测候选方法的随机误差。

批内重复性试验：目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内)及天间重复性试验

原理：批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价酶偶联反应测定血清中的肌酐随机误差的大小。

操作步骤：将血清标本用酶偶联反应测定血清中的肌酐作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。

计算：

1．按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数()、标准差(S)和变异系数(CV%)。

首先计算出每轮测定值的均数、标准差(Si)及方差S12 S22 S32、S42。再将5轮的总和代入公式即可算出批内标准差Sw。最后计算出变异系数(CV%)。（二）回收试验：通过计算回收率，检测候选方法的比例系统误差

试剂：

1．血清标本收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用

2．肌酐校准液

3．生理盐水。 4．其它试剂同酶偶联反应测定血清中的肌酐

操作步骤：1．样品制备

基础样品：血清0.9ml + 0.1ml生理盐水。

回收样品Ⅰ：血清0.9ml＋0.01ml 80mmol/L肌酐标准液＋ 0.09ml生理盐水。

回收样品Ⅱ：血清0.9ml＋0.06ml 80mmol/L肌酐标准液＋ 0.04ml生理盐水。

回收样品Ⅲ：血清0.9ml＋0.09ml 80mmol/L肌酐标准液＋ 0.01生理盐水。 2．血糖浓度测定按酶偶联反应测定血清中的肌酐，每份样品作双份检测，结果取平均值。

计算:

1．加入浓度计算:加入浓度(mmol/L)=标准液浓度×

2．回收量计算:回收量＝回收样品测得值－基础样品测得值

3．回收率计算:回收率(%)=×100

请将各计算结果填入表2-4内。

表2-4 回收试验的数据处理

样品测得浓度加入浓度回收浓度回收率(%)

(umol/L) (umol/L) (umol/L)

基础样品

回收样品Ⅰ

回收样品Ⅱ

回收样品Ⅲ

平均回收率。

(三)干扰试验：通过计算干扰值，检测候选方法的恒定系统误差。

试剂：

1．血清标本收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清，用酶偶联反应测定血清中的肌酐，再用生理盐水稀释到一定浓度备用

2．肌酐校准液

3．生理盐水。 4．其它试剂同酶偶联反应测定血清中的肌酐

操作步骤：

1．样品制备

基础样品：血清0.9ml＋蒸馏水0.1ml。

干扰样品Ⅰ：血清0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.05ml+蒸馏水0.05ml。

干扰样品Ⅱ：血清0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.1ml。

血液样品：蒸馏水0.9ml＋9.0mmol/L肌酐标准液0.1ml。

2．肌酐值的测定按酶偶联反应测定血清中的肌酐

计算：

1．干扰物加入值计算干扰物加入值＝干扰物溶液浓度×

2．干扰值计算干扰值(mmol/L)＝干扰样品测定值－基础样品测定值3．干扰率计算干扰率(%)＝干扰值/基础值×100

计算结果请填入表2-5内。

表2-5 干扰试验的数据处理

样品葡萄糖测得值加入值干扰值干扰率(%)

(umol/L) (umol/L) (umol/L)

基础样品－－－

回收样品Ⅰ

回收样品Ⅱ

样品

（四）方法比较试验：检测候选方法的系统比例误差。

1、用允许分析误差（EA）和医学决定水平(XC)判断候选方法能否接受。

评价试验中得到的结果，经统计学处理就能得出各种误差值，将其与确定的允许误差值EA进行比较。各项指标都小于EA，则表示该方法可以接受；任何一项指标大于EA，则表示不能接受。

单值判断指标，可信区间判断指标

误差类别判断指标备注

随机误（RE） 1.96STM＜EA STM：重复试验方法的

标准差

比例误（PE ）(|R-100|)(xc/100)＜EA R：平均回收率

恒定误（CE）|偏差|＜EA由干扰试验测出

系统误（SE）|(a+bXC)-XC|＜EA对比试验回归方程

总误差（TE） 1.96STM+|(a+bXC)-XC|＜EA包括随机及系统误差三、参考值与参考范围

从按若干标准规定的参考人群中选定一定数量的参考个体，通过检测所得结果，经统计学处理求得均值（X）和标准差（S），均值（X）即为参考值，而上述结果的95%的分布区间（X±2S）即为参考范围。

四、临床诊断性能

诊断试验评价四格表

金标准