10 改善睡眠功能检验方法

功能学评价检验方法－改善睡眠功能检验方法

1 实验动物

健康成年小鼠，单一性别，18-22克，每组10-15只。

2 剂量分组及受试样品给予时间

设1个空白对照组和3个受试样品剂量组，根据人体每日每公斤体重推荐摄入量，扩大10倍作为小鼠实验的一个剂量组，根据受试样品的具体情况另设两个剂量组。受试样品给予时间原则上经口连续给予30天，也可根据实验需要自行设定期限。

3 实验方法

3.1 直接睡眠实验

3.1.1 操作步骤：观察动物给予3个剂量的受试样品，对照组予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象、睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位如超过30-60秒不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录空白对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。

3.1.2 数据处理及结果判定睡眠时间为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

入睡动物数为计数资料用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

比较对照给与实验组入睡动物数及睡眠时间之间的差异，若入睡动物数及睡眠时间增加有显著性，则实验结果阳性。

3.2 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

3.2.1 原理

在戊巴比妥纳催眠的基础上，观察受试物是否能延长睡眠时间，若睡眠时间延长，则说明受试物与戊巴比妥纳有协同作用。

3.2.2 试剂

戊巴比妥钠（用前新鲜配制）

3.2.3 操作步骤

做正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量（30-60mg/kg），用此剂量正式实验。

动物末次给予溶剂对照及不同浓度受试样品后，出现峰作用前10-15分钟，给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.2mL/20g，以翻正反射消失为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

3.2.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异显显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

比较实验组与对照组睡眠时间延长之间的差异，睡眠时间延长有显著性，则实验结果阳性。

3.3 戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验

3.3.1 原理

观察受试物与戊巴比妥钠的协同作用。由于戊巴比妥钠通过肝酶代谢，而对该酶有抑制作用的药物，也能延长戊巴比妥钠睡眠时间，所以为排除这种影响，应进行阈下剂量实验。

3.3.2 操作步骤

正式实验前先进行预实验，确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量（16-30mg/kg.bw或巴比妥钠100-150mg/kgBW），VCB 80-90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阈下剂量。动物末次给予空白对照及不同浓度受试样品后，出现峰作用前10-15分钟，各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量，记录30分钟内入睡动物数（翻正反射消失达1分钟以上者）。实验宜在24-25℃安静环境下进行。

3.3.4 数据处理和结果判定

入睡动物数为计数资料用X2检验，四格表总例数小于40，或总例数等或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。

比较对照组与实验组入睡动物数之间的差异，入睡动物发生率增加有显著性，则实验结果阳性。

3.4 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

3.4.1 原理

在巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物是否能缩短入睡潜伏期，若睡眠潜伏期缩短，则说明受试物与巴比妥纳有协同作用。

3.4.2 试剂

巴比妥钠（用前新鲜配制）

3.4.3 操作步骤

做正式实验前先进行预实验，确定使动物100%入睡，但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的剂量（200-300mg/kg），用此剂量正式实验。

动物末次给予溶剂对照及不同浓度受试样品10-20分钟后，给各组动物腹腔注射巴比妥钠，注射量为0.2mL/20g，以翻正反射消失为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。

3.4.4 数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

比较实验组与对照组睡眠潜伏期之间的差异，睡眠潜伏期缩短有显著性，则实验结果阳性。

4 结果判定

延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠（或巴比妥钠）阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中二项阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有改善睡眠作用。

5 注意事项

5.1 实验室环境必须安静、恒温、恒湿、以确保条件的恒定。

5.2 由于动物自身固有的生物学特征和习性，对受试样品的反应存在着种属、性别、年龄等方面的差异。一般来说鼠类活动在夜间比白天活跃，雌性比雄性更明显，年龄大的动物中枢神经反应不敏感。这类实验应尽量安排在夜间同一时间进行，室温24-25℃为宜。

5.3 实验时应使动物在测定室适应数分钟后再进行正式测试，实验组与对照组交叉进行测试。