SOP-细胞常规维持培养

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）

细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。

当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。

经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。

2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。

2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。

2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。

2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。

SOP-细胞常规维持培养

SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。

二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。

悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。

细胞培养液制备SOP

1. 目的规范细胞培养液配制的操作。

2. 范围细胞生长液和细胞维持液的配制。

3.职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。

3.2. 质量管理部QC：负责本规程的操作。

3.3. 总经理：负责本规程的审批。

4. 定义无5. 引用标准无。

6. 材料6.1. 试剂6.1.1 配制好的MEM溶液，见《MEM培养基制备程序》6.1.2 配制好的谷氨酰胺溶液见《谷氨酰胺配制程序》6.1.3 配制好的双抗溶液见《双抗配制程序》6.1.37.5％碳酸氢钠见《双抗配制程序》6.2. 器械、用具6.2.1 移液管6.2.2 配液瓶6.2.3 75％洒精棉6.3 仪器设备6.3.1 高压灭菌器6.3.2 超净工作台7. 流程图无8. 内容8.1.细胞营养液的配制8.1.1. 配制前的准备8.1.2 消毒手部：将手用清水及肥皂洗净，用75%酒精棉球擦拭手的各个部位。

8.1.3. 超净台的启动：接通超净台开关，风机进入标准状态，开启紫外灯，运行20分钟。

8.1.4 将配液所需各种溶液及器具放入超净台。

8.2 配制过程8.2.1 穿好工作衣，带好帽子、口罩。

胳膊放入超净台内带好套袖和手套。

8.2.2. 用75%酒精棉球消毒手臂，解去HL/MEM瓶线，用酒精棉球消毒各种溶液瓶口，每擦一瓶换一块棉球，一瓶擦拭两遍。

8.2.3 轻轻拿下纸帽及棉塞，拔下溶液瓶塞，在酒精灯外焰处，将瓶口灭菌。

顺次加入所需各种营养液。

8.3 加液顺序8.3.1 MEM或DMEM8.3.2 血清 8～10％（或根据需要配制成2～5%，细胞维持液）8.3.3. 双抗 1%8.3.4 L-谷氨酰胺 0.45%。

1.0～2.0%8.3.5. 7.5%NaHCO38.3.6. pH 6.8～7.28.3.7. 盖好胶塞，备用。

9. 注意事项9.1 注意无菌操作9.2 配制好的细胞营养液一周内用完。

10. 附录及派生记录培养基配制记录F-SOP-ZL023-0111. 相关文件无12. 修订记录。

胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）

胚胎干细胞培养标准化操作规程（SOP）一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。

由Dr. Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。

贮存于4℃。

注：一瓶DMEM 是500ml。

贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。

SOPSC049-04冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)维持液及培养液配制标准操作规程

冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）维持液及培养液配制标准操作规程1 范围本标准适用于车间维持液及培养液的配制。

2 职责操作人员：严格按照该标准操作规程进行生产。

3 内容3.1 操作前的检查3.1.1 计量器具是否完好，性能与称量要求相符，并在检定有效期内。

3.1.2 检查水、电、气供应是否良好，纯化水及注射用水是否检验合格。

3.1.3 人员检查洁净室温度、湿度、压差是否符合要求。

3.1.4生产操作人员检查质量部门出示的尘埃粒子、沉降菌的检测报告是否符合相关规定，并在有效期内。

3.1.5 应对上一个班次的生产清场进行检查后，有QA下发的清场合格证，方可进行操作。

3.1.6检查高压灭菌柜、电子天平等设备状态标志，设备是否“完好”、“已清洁”。

3.1.7检查所需文件记录齐备，无与本批无关的指令及记录，无与本批无关的物料。

3.1.8 QA确认符合生产条件后，在批记录中签名准许生产。

3.1.9 及时填写并悬挂生产状态卡。

3.2 操作前的准备3.2.1 设备与材料的准备电子天平配液罐搅拌器pH计印度瓶量筒烧杯3.2.2 物料的准备199培养基灭能小牛血清人血白蛋白碳酸氢钠硫酸庆大霉素溶液注射用水3.3 配制过程3.3.1 维持液配制注射用水+199培养基+人血白蛋白+碳酸氢钠3.3.1.1 方法一：印度瓶配制3.3.1.1.1 将配制维持液所需的物品放在局部百级下的操作台上。

3.3.1.1.2 在火焰的保护下，用不锈钢止血钳启下原倍199培养液的瓶塞。

（10倍浓缩199培养液用灭菌的注射用水稀释成原倍199培养液）3.3.1.1.3靠近酒精灯火焰处，启下人血白蛋白的瓶塞，将人血白蛋白加入到原倍199培养液的瓶体中，摇匀。

3.3.1.1.4 靠近酒精灯火焰处。

启下7.5%碳酸氢钠溶液的瓶塞，用吸管吸取7.5%碳酸氢钠溶液加入到原倍199培养液的瓶体中，用pH计测试溶液pH值应在7.6～7.8范围内。

3.3.1.1.5在火焰的保护下，将单头分液管线安装在配制完的维持液的瓶口上，轻摇印度瓶将液体混合均匀。

细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：/yp/product-list-42.html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：/yp/product-list-43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

细胞培养技术操作规范

细胞培养技术操作规范细胞培养是一项重要的实验技术，用于研究细胞的生物学特性及其在疾病治疗和药物开发中的应用。

为了确保实验结果的准确性和可重复性，需要遵循一系列的操作规范。

本文档旨在提供细胞培养技术的操作规范，以帮助研究人员顺利进行实验。

实验室准备- 实验室应保持干净整洁，设施设备应处于正常运行状态。

- 所有使用的试剂和培养物应检查保质期，并妥善存放在适当的温度下。

- 工作平台及工作台面应进行消毒处理，以防止细菌和真菌的污染。

- 所有使用的器械和培养罐应在使用前进行高压蒸汽灭菌。

细胞培养操作细胞培养器具的准备- 使用无菌操作进行所有操作，包括试剂和培养基的添加、培养器具的取用等。

- 使用带无菌手套的清洁无菌工作台进行操作。

- 细胞培养器具（如培养瓶、孔板等）在使用前应进行高压蒸汽灭菌处理，确保无菌状态。

培养基的准备- 准备培养基前应检查其成分和配比是否正确，确保培养基的质量。

- 使用无菌操作取出所需量的培养基，并避免直接接触细胞培养器具。

- 遵循培养基的配制方法和步骤，确保其与细胞的适应性。

细胞的分离与传代- 分离细胞时，使用胰酶等消化酶进行细胞的释放，并遵循操作步骤和浓度要求。

- 记录分离细胞的季度数，避免过度传代，以保持细胞的稳定性和特性。

- 合理设置细胞传代次数和细胞数量，避免细胞过早进入衰老状态。

培养条件和操作- 确保培养器具与细胞接触的表面无菌、干净，避免细胞污染或黏附的问题。

- 控制培养环境的温度、湿度和二氧化碳浓度，以满足不同类型细胞的生长要求。

- 定期更换培养基，确保细胞得到足够的营养物质和生长条件。

- 注意培养器具和试剂的使用方法和操作顺序，避免对细胞生长和健康产生负面影响。

细胞培养操作的记录与管理- 记录每次细胞培养的详细信息，包括培养时间、细胞密度、培养基配制方法等，以便于实验结果的追溯和分析。

- 管理细胞的库存，包括标识、记录和储存，以确保细胞的可追溯性和可重复性。

- 定期检查细胞的污染和变异情况，及时采取必要的措施防止实验结果的偏差。

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。

(4)调节pH值至7.2~7.4。

(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。

细胞培养标准操作规程

细胞培养标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事细胞培养的实验技术人员和研究生。

二、操作规程
1、所需试剂细胞培养液、血清、胰酶、PBS或Hank`s液
2、规程：
2.1 细胞株的培养
2.1.1 获取所需细胞株（一般细胞株的运送是把细胞放在培养瓶中，干冰保存运输的）
2.1.2 得到所需细胞株后弃掉多余的培养液，放到5%的CO2培养箱中培养
2.1.3 每天至少观察一次，待细胞长满整个培养瓶的80%时传代
2.1.4 倒掉培养液，用1mlPBS 漂洗细胞一次，加入500ul胰酶消化，消化时间视细胞种类、胰酶浓度和消化温度而定，一般3-5min
2.1.5 终止消化，向上一步消化液中加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.1.6 吹打，用吸管轻轻吹打至细胞全部脱落，注意尽量减少气泡产生
2.1.7 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.1.8 将细胞接种到另外的培养瓶中
2.1.9 换液，根据细胞生长情况，间隔一定时间半量换液。

2.2 原代细胞培养
2.2.1 原代细胞的获取无菌条件下取动物组织剪碎
2.2.2 向剪碎的动物组织加入适宜浓度的胰酶，消化，时间因细胞种类和胰酶浓度而定
2.2.3 终止消化，向上一步消化叶重加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.2.4 吹打将终止消化后的组织转入一培养皿中，加入一定量的培养液轻轻吹打数次，静置5-10分钟
2.2.5 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.2.6 将细胞接种到培养瓶或培养板中，放入5%的CO2培养箱中培养。

细胞培养标准操作程序（SOP）

细胞培养标准操作程序（SOP）细胞培养标准操作程序（SOP）1．⽬的：为了保证培养细胞的正常⽣长，实验技术⼈员必须明确并正确执⾏细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2．适⽤范围：适⽤于来我院细胞室进⾏细胞培养⼯作的⼈员。

3．操作规程：3.1 培养液、PBS、胰蛋⽩酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备⽤品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电⼦分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）、NaHCO3粉、1000ml⽆菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉⽤900ml新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM 需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。

⽆需加⾕氨酰胺，因该培养基⾥已含有。

4、⽤1M（1mol/L）HCl 调PH⾄7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4⽣长，配制好后PH值会升⾼0.2～0.3，故配时调PH⾄7.0左右）。

5、⽤新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）定容到1000ml。

6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加⼊到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。

7、在⽆菌操作台⾥⽤0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶⼝⽤薄膜封⼝，盖上橡⽪塞，放-20℃保存备⽤。

注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使⽤的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）配制。

⼀般于配制当天制备，以保证⽔的纯度和质量。

（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先⾼压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）的容器均不需⾼压灭菌，⼲净即可。

标准操作规程(SOP)——细胞的保存和复苏

一、目的细胞的冻存和复苏是细胞培养的基本技术之一。

利用冻存技术可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞的保存和复苏。

三、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2，详见生物安全个人防护SOP 。

（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞：80%～90%成片，细胞生长良好，存活率高2．二甲基亚砜（DMSO ）(Singma CatNo D-5879)3．胎牛血清（GIBCO CatNo 16000）4．EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na ）（GIBCO CatNo 25300）5．D-MEM 培养液（含有L-谷氨酰胺）（GIBCO CatNo 11965）6．无菌移液管：1mL ，10mL7．37 ℃恒温水浴箱8．细胞生长液（见MDCK 细胞培养SOP ）9．70%～75%的酒精（三）实验步骤1．细胞冻存（1）冻存液的配制：9mL 胎牛血清，1mL 二甲基亚砜。

（2）细胞消化：用EDTA-胰酶消化细胞，具体步骤参见MDCK细胞培养标准操作规程（SOP ）——SOP中的细胞消化过程。

（3）细胞消化后，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。

（4）细胞冻存浓度为1×106/mL。

℃，-70℃过夜，放入液氮长期保存。

℃，-20 2h（5）细胞冻存过程：4 0.5h2．细胞的复苏冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。

细胞活化后，需要数日或继续传一至二代，其细胞特性才会恢复正常。

（1）将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70%～75%的酒精擦拭外壁后放入生物安全柜内。

（2）配戴防护面罩、防冻手套，从液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧。

（3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，用70%～75%酒精擦拭冻存管外部，移入生物安全柜内。

标准操作规程(SOP)——细胞计数

一、目的细胞计数法是细胞学实验中进行细胞计数的基本方法，通过细胞计数，能够保证实验的准确性、稳定性和可重复性。

二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞计数的操作。

三、定义细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。

一般利用计数板（红细胞计数板）进行。

即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。

不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

四、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞2．血细胞计数板3．1mL 、10mL 无菌移液管4．台盼蓝（0.4% PBS 溶液）建议：经常检查试剂使用的有效期（三）实验步骤1．消化细胞（方法见MDCK 细胞培养标准操作规程）。

2．用血细胞计数板来计算细胞悬液中的细胞数，需要充分分散细胞。

3．在18μL 台盼蓝（0.4% PBS 溶液）中加入2μL 细胞悬液，混匀，成10倍标准操作规程（SOP稀释。

死细胞被染成蓝色。

4．将以上细胞悬液加入到血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下计数。

5．计算计数室四个角上三线包围的正方形中的活细胞，压线的细胞计数遵循计数原则，数上不数下，数左不数右。

如果观察到成片或者成团的细胞，应重新悬浮细胞液，重新计数。

用以下公式计算每毫升悬液中活细胞的数量。

C=4个角正方形内的活细胞总数/4×104×10C：每毫升活细胞数；五、参考文件《流行性感冒诊断标准》。

NK细胞培养SOP

NK 细胞培养sop日程：第0天：NK激活剂的处理，分血第2天：补液20ml第4天：补液第7天：装袋第9天：补液第11 天：分袋第13 天：检菌第14、15 天：收获1. 研究背景与目的采用从病人自体外周血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使其扩增活化，再静脉回输，将其输回病人体内，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的的一种体细胞治疗方法。

2. 定义和缩写2.1. NK 自然杀伤细胞2.2. rhIL-15 人源重组白细胞介素152.3. IL-2 白细胞介素3. 主要仪器、耗材3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 流式细胞仪3.1.3 水平低速离心机3.1.4 灭菌锅3.1.5 CO 2 孵箱3.1.6 倒置显微镜3.1.7 血细胞记数器3.1.8 血细胞计数板3.1.9 移液器3.1.10 -20℃-4℃冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2培养瓶3.2.2 225 cm2培养瓶3.2.3 移液管3.2.4 15ml、50ml离心管、250ml离心管3.2.5 医用塑胶手套3.2.6 一次性帽子、手套3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 IL-2 (100万IU/瓶)3.3.3 IL-153.3.4 0.4%苔盼蓝溶液3.3.5 生理盐水3.3.6 人淋巴细胞分离液3.4 原材料3.4.1 外周血，脐血，骨髓等4 操作步骤分血：4.1 培养瓶的处理：吸取NK细胞激活剂500ul，用生理盐水稀释至6ml，加到75cm 2 的培养瓶中混匀后，放置于37°C。

1h后取出备用。

4.2 将不同来源的血样，用生理盐水稀释一倍；4.3 Ficoll密度梯度离心，2000rpm，25分钟；4.4 吸取血浆，置56°C，灭活20min；灭活血浆，3000rpm，15min；4.5 白膜层用移液管吸入到新的50ml离心管中，用生理盐水洗涤细胞两次，第一次为2100rpm，6min；第二次为1500rpm，6min；4.6 从培养箱中取出处理的培养瓶，吸除激活剂，加入生理盐水10ml，轻轻晃动培养瓶，吸除生理盐水；4.7 用10-15mlNK培养液重悬细胞悬液，同时补加10%血浆，1000U/ml的IL-2,50ng/ml IL-15；将细胞置于CO2培养箱中培养。

胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)

一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。

由Dr. Nagy的实验室制备。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。

为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。

分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

通过将21ml该溶液，HS 和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。

贮存于4℃。

注：一瓶DMEM 是500ml。

贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。

然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。

细胞培养标准操作程序(SOP).docx

细胞培养标准操作程序（SoP1.目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2 .适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

3 •操作规程：3.1培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 100Oml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2〜3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCo3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml× 10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2〜3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min。

2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。

3、充分搅拌,按说明添加成分（如InVitrogen公司的RPMl-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g , InVitrogen公司的DMEM需加NaHCo3粉3.7g等），再充分搅拌。

无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

4、用1M （1mol∕L ）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2〜7.4生长，配制好后PH值会升高0.2〜0.3 ,故配时调PH至7.0左右）。

5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。

6、配青霉素80万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml蒸馏水溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml ,充分搅拌混匀。

7、在无菌操作台里用0.22Um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20 C保存备用。

注意：（1 ）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。

一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

（2）准备的100ml× 10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。

细胞间操作注意事项

细胞间SOP操作所有操作人员必须在操作仪器前认真阅读此规程，使用时严格按照此规程步骤操作，首次使用者必须与该仪器主管人员联系。

仪器设备使用规范一、玻璃仪器清洗，灭菌操作1.第一次使用的玻璃仪器必须先用洗衣粉超声洗涤20min，用自来水清洗20遍后使用洗液润湿内壁24小时，然后用自来水清洗20遍，用milli-Q水清洗10遍，milli-Q水浸泡24hr，烘箱烘干后，120℃，20min灭菌，灭菌后，于细胞间里层晾干后才能使用。

[1]2.每次使用后，一定用自来水将管内的细胞用液残留冲洗干净后，置于洗衣粉或洗涤灵的水中浸泡超声洗涤20min。

若未出现污染，第二次使用的玻璃仪器则采用洗液润湿内壁3小时，然后自来水清洗20遍，milli-Q水清洗10遍，烘干灭菌同第一次使用操作。

若出现大规模污染，则采用第一次使用时的处理操作。

[2]二、灭菌锅的使用1.每次使用前，注意锅内水位是否达到标准，（详细标准参见说明书）。

检察锅内的水是否洁净。

一般一周以上必须更换。

[3]2.使用后，取出灭菌器材后，一定擦净锅内壁水珠，而且，用75%酒精进行擦洗。

三、超净台面清洁1.超净台在使用前，一定保证紫外灭菌达到30min以上。

关闭紫外灯，然后打开风扇，5min后开启日光灯，用75%酒精喷洗台面，点燃酒精灯。

[4]2.使用完毕后，尽量移出可以不放置在超净台内部的物品，转移至相关地方，用75%酒精擦洗台面，打开紫外灯灭菌。

离开操作室后，打开操作室紫外灯进行灭菌。

四、培养箱操作1.培养箱正常工作后，要保证CO2浓度在5%，温度在37℃，箱内水盘中不能断水。

CO2气瓶减压阀上指针不超过第二个小格。

[5]2.每次开启培养箱，需用75%酒精喷洗双手，取出细胞培养瓶后，立即旋紧瓶塞。

每次放入细胞培养瓶时，需要用75%酒精喷洗瓶口，在轻轻旋松，再放入培养箱中。

3.若出现大规模污染，则需对箱内进行彻底消毒。

采用方式为，先断去培养箱电源和CO2气源，撤去水盘，再用37%甲醛溶液喷洗箱内，密闭24小时，完成后，敞开箱门，打开空调换气24小时。

细胞冻存和复苏标准操作规程

细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。

因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

细胞培养操作规范

细胞培养操作规范细胞培养是生物学和医学研究中常用的实验技术之一，它能够提供一种研究和观察细胞行为和生命活动的方法。

然而，细胞培养需要遵循一些操作规范以确保实验结果的精确性和可靠性。

以下是一些常见的细胞培养操作规范：1.实验设计和预备工作在进行细胞培养之前，需要明确实验目的和设计实验方案。

确定所需的细胞类型、培养基、添加剂和培养条件。

还需要准备好所需的培养皿、培养瓶、培养箱、培养箱和实验室安全设备。

2.环境准备在进行细胞培养之前，必须确保实验室环境整洁、无尘和无菌。

使用消毒剂清洁工作台和实验室用具，包括各种器皿、试剂瓶口和培养箱内部。

3.无菌操作细胞培养需要保持无菌状态，因此在进行细胞培养操作前，必须进行多次的无菌操作，如用70%酒精消毒双手、清洗培养皿和培养瓶。

4.细胞传代和分离细胞有一定的生长能力，当细胞密度达到一定程度时就需要进行传代和分离。

为避免细胞老化和混合，需要根据实验需要确定传代时间和分离方法。

5.培养基和添加剂准备细胞培养所需的培养基通常由培养基和添加剂组成。

培养基需要事先准备好，按照实验要求加入适当的添加剂，如培养补充物、抗生素和生长因子等。

在添加添加剂之前，确保他们的无菌和适当浓度。

6.细胞接种和培养细胞接种是将细胞从已培养的细胞中分离出来并接种到新的培养皿或培养瓶中。

在接种前，需要观察细胞的形态、活性和浓度，确定接种密度，并通过染色和显微镜观察来判断细胞活性和纯度。

7.培养条件控制细胞培养需要保持适当的培养环境，包括适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。

对于不同类型的细胞，这些条件可能会有所不同。

要定期检查和记录培养箱和培养皿内温度、湿度和二氧化碳浓度，并及时调整。

8.细胞检测和分析在培养细胞的过程中，需要定期检测和分析细胞的生长状态和功能。

常用的方法包括细胞计数、细胞周期分析、细胞凋亡分析和表面标记等。

在进行这些分析时，需要选择适当的方法和试剂，严格按照操作流程进行。

9.实验室安全和废物处理在进行细胞培养操作时，必须注意实验室的安全问题。

生物医药领域细胞培养常规操作标准制定

生物医药领域细胞培养常规操作标准制定摘要：生物医药领域细胞培养是一项关键技术，其操作标准的制定对于细胞培养实验的准确性、可重复性和安全性至关重要。

本文旨在通过深入了解细胞培养的常规操作步骤和规范要求，以及目前行业中存在的问题和挑战，提供一些关键指导原则和建议来制定生物医药领域细胞培养常规操作标准。

1. 引言生物医药领域的细胞培养技术已成为基础和应用研究中不可或缺的一部分。

细胞培养是通过在体外培养基中提供营养物质和适宜的环境条件，使细胞得以生长、增殖和分化的过程。

然而，不同实验室和研究人员对于细胞培养的操作步骤和规范要求的理解存在差异，这导致了实验结果的可重复性和数据的可靠性问题。

2. 细胞培养常规操作步骤在制定细胞培养的常规操作标准之前，我们需要明确细胞培养的一般操作步骤。

常规的细胞培养操作包括以下几个重要步骤：2.1 细胞株的准备与传代在进行细胞培养实验之前，必须选择适宜的细胞株并进行初代传代。

细胞株的来源应可靠并且具备相关文献数据的支持。

细胞株的传代应在细胞到达对数生长期时进行，以确保细胞的良好状态。

2.2 培养基配制与调整正确配制培养基是细胞培养的关键，需要根据细胞类型和特殊的培养要求来调整培养基的成分和浓度。

常见的培养基成分包括营养物质、生长因子、血清和抗生素等。

2.3 细胞的传代与扩增传代培养是保持细胞生物学特性和细胞株稳定性的重要步骤。

细胞传代时，应注意传代的次数和比例，以避免细胞老化和突变。

2.4 细胞的定居和附着将细胞悬浮液加入培养皿后，细胞需要时间与培养皿表面相互作用以完成附着过程。

此过程需要细胞培养皿的预处理，如涂覆基质或使其表面亲水性适宜。

2.5 细胞培养条件的控制与调节细胞培养过程中，必须严格控制和调节的条件包括培养温度、CO2浓度、湿度和培养皿的气密性等。

这些条件的优化将直接影响到细胞的生长、增殖和细胞特性的稳定性。

3. 细胞培养操作标准的制定制定细胞培养操作标准应基于实验室内外的数据以及行业的共识。