2013(第6章)酶工程
酶工程
催化基团
维持酶的空间结构
催化性质
由表可知，活性中心上有7种氨基酸的频率 组成酶活性中心的重要化学基团 最高，分别是： Ser,His,Cys,Tyr,Asp,Glu,Lys 酶
胰蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 木瓜蛋白酶 乳酸脱氢酶 G6P脱氢酶(酵母) 苹果酸脱氢酶 核糖核酸酶 葡萄糖磷酸变位酶
活性中心上的基团
Novo Nordisk诺和诺德 （丹麦）
Genencor International 杰能科国际有限公司
(美国）
Cuitor(芬兰）
三大公司销售额占世界总额的70%
国际市场酶制剂销售额比例
2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元
其它行业用酶 焙烤食品用酶 洗涤剂用酶 纺织用酶 乳制品用酶 酿酒用酶 饲料用酶 焙烤食品用酶 其它行业用酶
定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种 因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 酶具有一般催化剂的特征： 1.只能进行热力学上允许进行的反应；
2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平 衡点；
3.通过降低活化能加快化学反应速度。
酶学研究简史
1878 德国的Kuhne 定义Enzyme 原意为在酵母中
(3)
水解酶 hydrolase
水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：
R COOCH2CH3 H2O RCOOH CH3CH2OH
(4)
裂合酶 Lyase
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或 原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。
5酶工程
粉酶。
1969年，日本科学家首先在工业上应用固定化氨基 酰化酶生产出 L-氨基酸。同年，开始使用“酶工程” 这代表生产和使用酶制剂这一新兴的科技领域。
1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召 开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。 20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定 化细胞技术。 1978年，日本科学家用固定化 细胞成功地生产出α -淀粉酶。 1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵 生产 碱性磷酸酶 和 葡萄糖氧化酶 等获得成 功，为酶工程的进一步发展开辟了新的途径。
（二）发酵法
发酵法主要通过微生物发酵来获得人们所需要 的酶。
1、微生物酶发酵生产概念：
微生物酶的发酵生产：是指在人工控制的条件 下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶， 其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条 件的控制管理等方面的内容。
2、生产流程：
1）优良产酶菌种的筛选
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生 产需要的菌种是发酵产酶的首要环节,优良的产酶 菌种应具备：
2、细胞固定化的主要方法
（1）包埋法 将细胞包埋在多微孔载体内 部制备固定化细胞的方法，可分为凝胶 包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法。 其中凝胶包埋法是应用最广泛的细 胞固定化方法，适用于各种微生物、动 植物细胞的固定化。 优点：能较好地保持细胞内的多酶 反应系统的活力，可以像游离细胞那样 进行发酵生产。
心、过滤、浓缩、干燥这几个步骤，对某些纯
度要求很高的酶则需经几种方法乃至多次反复 处理。 难度大、成本高（占50-80%）
(1)破碎细胞
除了胞外酶的提取以外，所有
胞内酶均需将细胞壁破碎后方可进一步抽提。
酶工程
名解：酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
也是酶的生产、改性与应用的技术过程。
自杀性底物：底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露，再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂，这种底物叫自杀性底物。
别构酶：调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶诱导酶：有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。
抗体酶：是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶Mol催化活性：表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目离子交换层析：利用离子交换剂作为载体这些载体在一定条件下带有一定的电荷，当带相反电荷的分子通过时，由于静电引力就会被载体吸附，这种分离方法叫离子交换层析。
固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶酶反应器：是利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，他为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物。
底物抑制：在酶促反应中，高底物浓度使反应速度降低的现象。
稳定pH：酶在一定的pH范围之内是稳定的，超过这个限度易变性失活，这样的pH范围为此酶的稳定pH产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。
凝胶过滤：又叫分子排阻层析，分子筛层析，在层析柱中填充分子筛，加入待纯化样品再用适当缓冲液淋洗，样品中的分子经过一定距离的层析柱后，按分子大小先后顺序流出的，彼此分开的层析方法。
非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学液体发酵法：以液体培养基为原料进行微生物的繁殖和产酶的方法，根据通风方法不同又分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。
酶工程考试重点
第一章：绪论◆酶：由生物体产生的具有生物催化功能的生物大分子，按照分子中起催化作用的主要组分的不同，自然界中天然存在的酶可以分为蛋白类酶（protein enzyme)和核酸类酶◆酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程◆锁与钥匙学说：底物结构必须与酶活性部位的结构非常互补，就像锁与钥匙一样，这样才能紧密结合，形成酶-底物复合物。
这个学说可以解释酶的绝对专一性，但是不能解释酶的相对专一性。
◆诱导契合理论：酶分子活性中心的结构并不与底物分子的结构互补,但活性中心有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性中心的各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向，从而使酶与底物互补结合，产生酶-底物复合物，并使底物发生化学反应◆中间产物学说：酶首先与底物结合成酶-底物复合物，然后转变成酶-过渡态中间物复合物，然后，生成酶-产物复合物，最后从酶分子上释放产物，从而大大降低反应的活化能（分子由基态转变为过渡态即活化态所需的能量）。
◆Km 值是当酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度◆竞争性抑制：抑制剂竞争性与酶的活性中心结合，从而阻止底物与酶的结合。
这是最常见的一种可逆抑制作用。
随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。
Vm 不变，Km 增大◆非竞争性抑制：底物和抑制剂可以同时与酶结合，抑制剂结合于活性中心以外的部位，两者没有竞争作用，但影响产物的释放，Vm 降低，Km 不变◆反竞争性抑制Vm 降低，Km 减小◆酶活力：酶催化底物发生化学反应的能力。
测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度。
酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。
◆酶的比活力：每毫克酶蛋白（酶制剂）所含的酶活力单位数称为酶的比活力，用U／mg 蛋白表示。
酶的比活力是酶制剂的一个纯度指标。
对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶纯度愈高。
◆酶的生产方法：.提取分离法；生物合成法；化学合成法第二章：微生物发酵产酶结构基因、操纵基因与启动基因一起组成操纵子，分为诱导型与阻遏型。
酶工程教案
酶工程简介酶工程（enzymeengineering）是在1971年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。
酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。
第一章酶学概论（Enzyme）新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。
而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化下进行的。
生命的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。
第一节酶的一般概念一、酶的概念及化学本质（一）酶的概念：酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。
（二）酶的化学本质：绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。
本章主要讨论以蛋白质为本质的酶。
二、酶的组成与分类（一）根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、多成分酶（复合酶）单纯酶(simpleenzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。
它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。
复合酶(conjugatedenzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，全酶酶蛋白辅助因子(结合蛋白质) (蛋白质部分)(非蛋白质部分)酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。
常见酶含有的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。
它们或者是酶活性的组成部分；或者是连接底物和酶分子的桥梁；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。
小分子有机化合物是一些稳定的小分子物质，其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团，常可按其与酶蛋白结合的紧密程度不同分成辅酶和辅基两大类。
酶工程 第六章
第一节 酶固定化
(3) 酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一 步的分离纯化带来一定的困难。 为此，人们针对酶的不足寻求其改善方法。其办法之 一就是固定化技术的应用。 固定化酶的研究从上个世纪50年代开始，l953年德国 的格鲁布霍费(Grubhofer)和施莱思(Schleith)采用聚氨 基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、 淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。 20世纪60年代后期，固定化技术迅速发展。 l969年，日 本的干佃一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶 从DL-氨基酸连续生产L—氨基酸，实现了酶应用史上的一 大变革。此后，固定化技术迅速发展，促使酶工程作为一 个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。在1971年召开的第 一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名 称为Immobilized Enzyme。
第二节 酶和菌体固定化
(2)半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包理在由各 种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜 等。 半透膜的孔径为几埃至几十埃，比一般酶分子的直径 小些，固定化的酶分子不会从小球中漏出来。但只有小于 半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透 膜，而大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物都无法 进出。故此，半透膜包埋法运用于底物和产物都是小分子 物质的酶的固定化。例如：脲酶、天门冬酰胺酶、尿酸酶、 过氧化氢酶等。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
葡萄糖标准曲线制作 滤纸酶活力(FPA)的测定 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定
D 3酶活定义
D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。
D 3.2滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)
A 2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1
B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)
B 2.1葡萄糖标准曲线制备：
①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于( 103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,
lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。
D 3.3羧甲基纤维素酶活力( CMCA)
D 3.3.1还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。
⑥以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
D 4.3滤纸酶活力(FPA)的测定步操作流程：如表二所示：
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5实验处理
A 5实验现象、数据及观察结果
A 5.1标准曲线的测量结果：如表四：
试管编号
0
1
2
3
4
5
OD（540nm）值
—
0.0595
0.2135
0.345
0.493
B 4.2滤纸条的准备：
①将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:
②将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为(50士05)mg的滤纸条，折成M型备用。
B4.3操作步骤:
①取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，二支样品管)。实验中分为两组：pH
4.8与pH6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。
步骤7
加入0.5mL待测酶液，
沸水浴煮沸10min
沸水浴煮沸10min9
加蒸馏水定容至25mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
（注意：OD =（A+B）/ 2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）
表二
D4.4羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定操作流程:如表三所示：
XX
XX
1、实验目的
1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；
1.2学习酶活力的测定方法；
1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；
1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
A2.1滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。
酶工程
酶工程酶的定义及其本质：指一类具有高效率的特异性的生物催化剂。
酶是具有催化活性的：蛋白质(enzyme),核酸(ribozyme),或脱氧核酸(deoxyribozyme).酶工程：它是一项利用酶、含酶细胞器或细胞作为生物催化剂来完成重要化学反应，并将相应底物转化成有用物质的应用型生物高新技术。
1971年，美国，第一届国际酶工程会议，确认：酶工程的核心内容酶的生产与应用主要涉及：①酶的产生；②酶的分离纯化；③酶的固定化；④酶分子的定向改造与修饰；⑤酶生物反应器；⑥酶的应用。
第一章酶的命名和分类国际系统分类法及编号（EC编号）系统编号方法是将每一种酶用4个数字编号，中间以“.”隔开。
第一个数字表示反应性质，分六大类，用1、2、3、4、5、6表示；第二个数字表示亚类，根据底物被作用的基团或键的特点标号；第三个数字表示亚亚类，更精确反应了所催化反应底物或反应物的性质第三个数字表示亚亚类下的个别酶的顺序号，一般按酶的发现先后次序进行排列。
1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1氧化还原酶，2转移酶，3水解酶，4裂合酶，5异构酶，6合成酶酶的组成：单纯酶，结合酶（全酶）=酶蛋白+辅助因子辅助因子：辅酶，辅基，金属激活剂（金属离子作为辅助因子）酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。
辅助因子通常是作为电子，原子或某些化学基团的载体。
酶的分子结构：活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。
活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。
(结合基团——专一性，催化基团——催化性质)维持酶的空间结构酶活性中心特点：1）活性中心的某些功能基因是酶的必须基团。
2）活性中心只占酶分子的很小一部分3）酶的活性中心是一个三维实体4）酶的活性中心并不是和底物的形状正好互补的5）酶的活性中心是位于酶分子表面的一个裂缝内6）酶与其专一性底物的结合通过次级键实现的酶催化作用的特点：温和性，专一性，高效性，可调性酶含量的调节（合成和降解），酶活性的调节共价调节；别构调节；（协同效应，同/异促效应）；反/前馈调节；激素调节；同工酶调节第二节酶反应动力学1. 酶活力与酶促反应速度酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。
酶工程
酶，指具有生物催化功能的高分子物质，在酶的催化反应体系中，反应物分子被称为底物，底物通过酶的催化转化为另一种分子。
几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。
与其他非生物催化剂相似，酶通过降低化学反应的活化能（用Ea或ΔG表示）来加快反应速率，大多数的酶可以将其催化的反应之速率提高上百万倍；事实上，酶是提供另一条活化能需求较低的途径，使更多反应粒子能拥有不少于活化能的动能，从而加快反应速率。
酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。
酶有正催化作用也有负催化作用，不只是加快反应速率，也有减低反应速率。
与其他非生物催化剂不同的是，酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。
虽然酶大多是蛋白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子也具有催化功能。
此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶类似的催化活性，包括人工合成的DNA。
有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂。
酶的催化活性会受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。
有许多药物和毒药就是酶的抑制剂。
酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。
一、研究历史1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani，1729—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。
过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。
于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。
但是什么，他不清楚。
1833年，法国的培安和培洛里将磨碎麦芽的液体作用于淀粉，结果发现淀粉被分解，于是将这个分解淀粉的物质命名为Diastase，也就是现在所谓的淀粉酶。
后来，Diastase在法国成为用来表示所有酶的名称。
1836年，德国马普生物研究所科学家施旺（T.Schwann，1810—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质，解开消化之谜。
酶工程实验报告六(纤维素酶的固定化及其性质测定)
3、用注射器将上述混合液取20ml（各取四次）逐渐滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中
6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。
（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。
（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。
7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。
④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5、实验结果与数据处理：
5.1实验数据与结果：
表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较
保温时间（min）
吸光度OD540、酶活（u/g）、相对酶活(%)
固定化纤维素酶酶
游离纤维素酶酶
10 0.0375 639.04 33.63 0.0585 7586.50 65.23
②酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲线斜率较陡曲）；而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓），即稳定性较高。
③不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5%达最大相对酶活性100%。
酶工程最终版
绪论1.何谓酶工程, 试述其重要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的重要内容涉及: 微生物细胞发酵产酶, 动植物细胞培养产酶, 酶的提取与分离纯化, 酶分子修饰, 酶、细胞、原生质体固定化, 酶非水相催化, 酶定向进化, 酶反映器和酶的应用等。
酶工程的重要任务是通过预先设计, 通过人工操作获得人们所需的酶, 并通过各种方法使酶的催化特性得以改善, 充足发挥其催化功能。
2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂, 与非酶催化剂相比, 具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3.简述影响酶催化作用的重要因素。
酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、克制剂浓度等诸多因素的影响。
5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
酶活力单位: 在特定条件下（温度可采用25℃, pH等条件均采用最适条件）, 每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位, 这个单位称为国际单位（IU）。
在特定条件下, 每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法, 酶柱测定法, 连续测定法, 固定化酶的比活力测定, 酶结合效率与酶活力回收率的测定, 相对酶活力的测定。
或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史: 4000数年前的夏禹时代——酿酒技术。
3000数年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。
1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。
19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。
192023——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说, 推导出米氏方程。
1926年——萨姆纳得到脲酶结晶, 并证明它具有蛋白质的性质。
1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。
1982年——切克发现核酸类酶。
1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。
酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。
酶工程final课件
Enzyme proteins 酶是由生物体产生的具有催化 剂活性的蛋白质。
Ribozyme RNAs 核糖核酸质酶本身就是一段 RNA，特异性地催化某个反应， 识别和剪切RNA某个位点。
1
酶的来源
植物组织提取
蛋白酶、淀粉酶
动物组织提取
胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶
微生物发酵
生长繁殖快，生活周期短, 产量高
根据酶分子专一性结合的分离方法：亲和层析、共价层析 根据分配系数的分离方法：双水相萃取
15
酶的分离纯化
酶制剂的保存
温度
一般在0-4℃比较稳定
缓冲液
特定的pH范围
氧化/还原
加入还原剂或在氮气中保存
酶的浓度及纯度
浓度越高越稳定，晶体或干 粉更有利于保存
16
酶分子的改造
酶在实际应用中的局限性
1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被 识别降解 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验， 半衰期短、易变性失活 3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产 工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。
以酶为催化剂进行反应所需要的设备称为 酶反应器
均相酶反应器：应用游离酶进行的反应的 非均相酶反应器：应用固定化酶进行反应的
可根据催化剂的形 状选择酶反应器
粒状催化剂 细小颗粒状催化剂 膜状催化剂
32
生物传感器
利用生物物质(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生 物膜、微生物、细胞等)作为识别元件，将生化反应转 变成可定量的物理、化学信号，从而能够进行生命物质 和化学物质检测和监控的装置。
系
⑥抗污 染能力
强
29
固定化酶和固定化细胞的形状
⑴颗粒状 固定化酶
酶工程
概念1.化学酶工程：（初级酶工程）通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成方法制造人工酶。
2.凝胶过滤：又称分子筛层析排阻层析。
是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行的分离的技术。
3.流化床反应器：将适量的粉状或颗粒状固定化酶悬浮于反应器中，不搅拌，而由同上的底物液流的冲击作用，使固定化酶颗粒在活动状态下进行反应。
4.定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤如突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。
5.蛋白质工程：是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术。
简答1. 微生物发酵产酶过程中，提高酶产量的措施有哪些？答：1）添加诱导物2）控制阻遏物浓度3）添加表面活性剂4）添加产酶促进剂2. 与化学反应器相比,酶反应器有以下几个特点？答：1）对材质的要求一般不高2）专一性强3）要尽量保护生物催化剂的催化活性4）反应条件调控设施较为复杂5）必须考虑便于清洗和消毒灭菌3. 咪唑基的化学修饰的来源，修饰反应和修饰剂（每种修饰反应至少写出一种对应的修饰剂）？答：来源：（His）组氨酸修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂：常用焦碳酸二乙酯、碘乙酸烷基化修饰剂：乙酸酐4.常用的酶的固定化方法有哪些？答：1）吸附法2）结合法3）交联法4）包埋法5. 蛋白质分子设计的原则？答：1）活性设计2）对专一性的设计3）scaffold（框架）设计4）疏水基团与亲水基团需合理分布5）最优的氨基酸侧链几何排列6. NMR法测定蛋白质溶液结构有哪些特点？答：1）可以测定接近于生理状态的溶液中的蛋白质构象2）可以测定小分子和蛋白质作用的动力学过程3）可以测定蛋白质可变形的尾巴部分的构象4）是一种非损伤性测定法。
酶工程
二、酶工程简介由酶学与化学工程、基因工程、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
（酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程）分为：化学酶工程与生物酶工程。
1.化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。
主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
2. 生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。
利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。
固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅助因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。
用微生物和动植物组织研究生物传感器。
非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。
一、酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。
国际酶学委员会（EC）规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：EC 数字.数字.数字.数字乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1第一个“1”——第1大类，即氧化还原酶类；第二个“1”——第1亚类，供氢体为CHOH；第三个“1”——第1亚亚类，受氢体为NAD+；第四个“1”——在亚亚类中的顺序号。
-酶工程简介ppt课件
Buchner兄弟的试验：
用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液 不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二 氧化碳。 证明：发酵与细胞的活动无关。
34
The Nobel Prize in Chemistry 1907
"for his biochemical researches and his discovery of cell-free
19
生物催化剂发展的工业展望
Competitive Imperative
Speed to Market
Current Chemical Varieties
2-5 years
Current Biocatalyst
s
10 years
Biocatalyst of the Future
2-3 years
Cost to Manufacture
机结合而产生的边缘交叉科学。
• 应用主要集中于食品工业、工业和医药工业等领 域。
• 酶工程是生物技术的重要组成部分。
3
二、酶工程相关概念
生物工程(Bioengineering)又称生物技术 或生物工艺学(Biotechnology). 20世纪70 年代发展起来的一门新的综合性技术学科。 综合运用生物学、化学和工程学技术，改造 物种、创造新物种，改造生物体中的某些组 分(如酶、蛋白质、核酸、细胞器)，利用生物 体的某些特殊机能(如酶的催化功能、抗体 的免疫功能等) 为工农业生产以及医疗卫生 服务。
that enzymes
virus proteins in a pure form"
can be
crystallized"
James Batcheller Sumner
酶工程基本原理课件
是：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导 ，其构象发生有利于与底物分子结合或催化的变化，酶 与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。
酶工程基本原理课件
9
锁 钥 学说
关换别区句4.构域话酸酶，说碱多这，催为个 酶化代特的谢定活区性代域中谢即心调酶是节的酶酶活分，5性子由.微中上别环心 的构境与(部ac的底位tiv物影的e 结c变响en合构te并r)，
改催邻变化近酶反效的应应活的是性指特，A定和别基B构两团个部或底位特物的定分变子区构结域合也。在是酶通分过子与的结一合个部配位上，
电荷中继网： Ser195—His57—Asp102氢键体系。 通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。
没有底物时， Ser195—His57—Asp102形成一个 氢键体系，His57是去质子化状态， Asp102的 COO-通过氢键定位并固定His57。
结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增 加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性，
按一定的方向重叠或交叉，这一方向稍有偏离，反应就难以进行
或例增加如很溶大菌能酶量:才由能12进9行个，A这A种构酶成活, 性而部构位成赋活予性底物中的心这的一A方A向
性有即定:G向lu效35应, A。sp52, Try62, Asp101(Gly101) 构成.
酶工程基本原理课件
8
CH 2.1 酶的结构和功能
酶工程基本原理课件
2
CH 1.1 酶的基本概念
2剂只变1证法蛋物专酶3化底类是反明进白酶例酸酮质一剂物酶酶似催应具了行质如生酸酶一进性是绝，的相是酶，化述催：成生有的研两的般对行。根分对蛋作C一乳L成酶反度化C，究部专据子化催情相-=为专H乳酸D白种在应，O酶一结研；分学反-况生同化酸脱一乳生的性催的并构质究，物本下类而氢酸应性活专是、物化进不催乳酶蛋D酶质，型一指空是具性－酸催化反行改(的白是L一的化一间指脱乳剂有a化应，变化质程种构蛋c个氢反酸，一t剂时此反a专度酶型酶学部白t脱结应其种e，，，外应只及一本分d氢催质构，能e可构能在其，的h酶化质称，性完主y分象催够(催d本酶平反E，为H这整r要为的化和催Co应－化身在衡g可辅绝不一一的是1Ce的化高.活n不催。1对－同种用基C点酶a对专.一1H效sO性专发化酶都底.e研酶一是2包某H类E8一物表上生 反 催性性)究 蛋C被括一却性进现结与化应化远1蛋白只生蛋化和行出.构1远无学时反.能白，相一专物1白学超相.机2改，应催对种一质非化7质键过似)化催专变仅的反性催的蛋无学和的催的一应。化化，改动机方白所非化性，丙催丙。酮
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4. 基质 主要酶类: 三羧酸循环酶系(其中苹果酸脱氢 酶为标志酶), 脂肪酸β氧化酶, 谷氨酸脱氢 酶, 天冬氨酸转氨酶,蛋白质和核酸合成酶
系, 丙酮酸脱氢酶复合。
功 能: 三羧酸循环, 脂肪酸β氧化, 蛋白质合
成, DNA复制, RNA合成
五、氧化磷酸化
线粒体主要功能是进行氧化磷酸化，合成 ATP，为细胞生命活动提供直接能量；与细胞 中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转
2、线粒体融合与分裂 的细胞生物学基础
线粒体的分裂表现为线粒体内外膜同时发生内陷并最
终在内陷处被子分断的过程：
（1）早期：线粒体分裂的准备阶段，膜内陷尚未发生； （2）中期：线粒呈现环形内陷并逐渐加深； （3）后期：线粒体膜被分断，线粒体一分为二。
三、线粒体的超微结构
功能区隔: 分为外膜、内膜、膜间隙和基质四部分。
1、氧化磷酸化的分子基础
(1)氧化磷酸化过程实际上是能量转换 过程， 即有机分子中储藏的能量高 能电子质子动力势ATP
(2) 氧化(电子传递、消耗氧, 放能)与磷
酸化(ADP+Pi→ATP，储能)同时进行，
密切偶联，分别由两个不同的结构体系
执行。
2、电子传递链的四种复合物(哺乳类)
呼吸链组分按氧化还原电位由低向高的方向排列。 利用脱氧胆酸(盐)处理线粒体内膜, 分离出呼吸链的4种复合物。 辅酶Q不属于任何一种复合物。
溶性酶、 底物及辅助因子。是内外膜之间的
腔隙，宽约6-8nm。标志酶为腺苷酸激酶。
4. 基质（matrix）：含三羧酸循环酶系、线粒体 基因表达酶系等以及线粒体 DNA, RNA，核糖 体。 标志酶为苹果酸脱氢酶。DNA聚合酶、氨基酸 活化酶等, 纤维丝和电子密度很大的致密颗粒 状物质，内含Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子。
2、复合物II：琥珀酸脱氢酶
组成：至少由4条肽链，含有一个FAD
（黄素腺嘌呤二核苷酸），2个铁硫蛋白。
作用：催化琥珀酸的低能 电子至辅酶Q，
但不转移质子。 琥珀酸→FAD→Fe-S→Q 琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2
3、复合物III：细胞色素还原酶。
组成：至少11条不同肽链，以二聚体形式存 在，每个单体包含两个细胞色素b（ b566 、 b562）、一个铁硫蛋白和一个细胞色素c1 。 作用：催化电子从辅酶Q传给细胞色素c，每 转移一对电子，同时将4个质子由线粒体基质泵 至膜间隙。 2还原态cyt c1 + QH2 + 2 H+M→2氧化态cyt c1 + Q+ 4H+C
第六章 细胞的能量转换──线粒体和叶绿体
●线粒体与氧化磷酸化 ●叶绿体与光合作用
●线粒体和叶绿体是半自主性细胞器
●线粒体和叶绿体的增殖与起源
第一节 线粒体与氧化磷酸化
●线粒体的基本形态及动态特征 ●线粒体的功能 ●线粒体与疾病
一.线粒体的形态、大小、数量与分布
1. 粒状或杆状。蛋白占干重的65-70%，脂类
电子载体
1、NAD：即烟酰胺嘌呤二核苷酸，连接三羧
酸循环和呼吸链，将代谢过程中脱下来的
氢交给黄素蛋白。
2、黄素蛋白：含FMN或FAD的蛋白，可接受 2个电子2个质子。黄素相关的脱氢酶类有： ①以FMN为辅基的NADH脱氢酶。②以 FAD为辅基的琥珀酸脱氢酶。
3、细胞色素：分子中含有血红素铁，以共价 形式与蛋白结合，通Fe3+、Fe2+形式变化传 递电子，呼吸链中有5类，即：细胞色素a、 a3、b、c、c1，其中a、a3含有铜原子。 4、铁硫蛋白：在其分子结构中每个铁原子和4 个硫原子结合，通过Fe3+ 、 Fe2+互变进行电 子传递，有2Fe-2S和4Fe-4S两种类型。
(1) 含100种以上的多肽，蛋白质和脂类的比 例高于3:1。心磷脂含量高（达20%）、缺 乏胆固醇，类似于细菌质膜。
(2) 通透性很低，仅允许不带电荷的小分子 物质通过。 (3) 氧化磷酸化的电子传递链位于内膜。标 志酶为细胞色素C氧化酶。
(4) 内膜向线粒体内室褶入形成嵴（cristae）， 能扩大内膜表面积（达5~10倍），嵴有两种： ①层状、②管状。
柄部（stalk section）:
由F1的γ亚基和ε亚基构成柄 部，将头部与
基部连接起来。γ亚基穿过头部作为头部旋转
的轴。构成基部的b亚基向外延伸成为柄部的
构成部分。
膜部(memebrane section):
即F0，是由镶嵌在线粒体内膜的疏水性蛋白
质所组成，由3种不同的亚基组成的15聚体。其
5、辅酶Q：是脂溶性小分子量醌类化合物， 通过氧化和还原传递电子。有3种氧化还 原形式，即：氧化型醌Q，还原型氢醌 （QH2）和介于两者之者的自由基半醌 （QH）。
两条主要的呼吸链 ①由复合物I、III、IV组成，催化NADH的脱 氢氧化。 ②由复合物II、III、IV组成，催化琥珀酸的脱 氢氧化。
用）。
(1) ATP、NAD、辅酶A等的分子质量都小
于1KD，能自由通过外膜。
(2) 外膜通透性非常高，使得膜间隙环境几
乎与胞质溶胶相似。 (3) 外膜含有一些特殊的酶类，如参与色氨 酸降解、脂肪酸链延伸的酶。参与膜磷脂 的合成，并将进入线粒体基质内进行彻底
氧化的物质先行初步分解。
2、内膜 （inner membrane）
跨膜 GTPase大分子的模式图
与Fzo具有高度同源的基因家族广泛存在于酵母和 哺乳动物的基因组中。这些基因编码结构类似的 大分子GTPase，基核心功能也是介导线粒体融合。 哺乳动物中GTPase被称作线粒体融合素，而编码 线粒体融合素的Fzo同源基因被称作Mfin .
线粒体分裂必需基因（如酵母中Dnm1、大鼠中的 Drp1）的产物定位。 Dnm1和Drp1属发动蛋白，同 样是一类大分子GTPase。
四、线粒体的化学组成及酶的定位
●线粒体组分分离方法 ●线粒体的化学组成 ●线粒体酶的定位
线 粒 体 组 分 分 离 方 法
线粒体的化学组成
◆蛋白质(线粒体干重的65～70％)
◆脂类(线粒体干重的25～30％)：
磷脂占3/4以上，外膜主要是卵磷脂， 内膜主要是心磷脂。 线粒体脂类和蛋白质的比值: 0.3:1（内膜）； 1:1（外膜）
(5) 嵴上有许多排列规则的颗粒称线粒体基粒。 基粒由头部（F1）和基部（F0）构成 ，是 ATP合成酶，又叫F0F1ATP酶复合体。 ·执行氧化反应的电子传递链
·ATP合成酶
ATP合酶的负染 电子显微构型
ATP合酶的分子 结构模式图
3.膜间隙（intermembrane space）：含许多可
电子传递链的四种复合物(哺乳类)
1、复合物I：NADH脱氢酶。 组成：42条肽链，呈L型，含一个FMN(黄素单 核苷酸）和至少6个铁硫蛋白，分子量约1MD，以二 聚体形式存在。 作用：催化NADH的2个电子传递至辅酶Q (CoQ)，同时将4个质子由线粒体基质（M侧）转移 至膜间隙（C侧）。 NADH→FMN→Fe-S→Q NADH + 5H+M + Q→NAD+ + QH2 + 4H+C
占25-30%。直径0.5~1μm，长1.5~3.0μm，
在胰脏外分泌细胞中可长达10~20μm，称巨
线粒体。
2. 肝细胞约1300个线粒体，占细胞体积的20%， 许多哺乳动物成熟的红细胞无线粒体。
3. 通常分布在细胞功能旺盛的区域。可向 细胞功能旺盛的区域迁移，微管是其导轨、 马达蛋白提供动力。
◆高能电子释放的能量驱动线粒体内膜三大
复合物 (H+- 泵 ) 将 H+ 从基质侧泵到膜间隙，
形成跨线粒体内膜H&各组分在膜上不对称分布。
3、ATP合成酶(磷酸化的分子基础)
（1）ATP合酶，属F型质子泵。分为球形的F1 （头部）和嵌入膜中的F0（基部）。是一个多 组分的结构。在分离状态下具有ATP水解酶的
中c亚在膜 中形成物质运动的环，b亚基穿过柄
部将F1固定，由a、b、c3种亚基按照ab2c10-12的
Schematic view of mitochondrion
人体淋巴细胞线粒体
拟南芥幼叶线粒体
模式图
1. 外膜 (out membrane)
含40%的脂类和60%的 蛋白，具有孔蛋白(porin) 构成的亲水通道，允许分 子量5KD以下的分子通过，
1KD以下的分子可自由通
过。标志酶为单胺氧化酶 （终止胺神经递质的作
导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态
平衡的调控有关。
主要内容
●氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)的 分子基础
●氧化磷酸化的偶联机制—化学渗透假说
(Chemiosmotic Hypothesis, Mithchell,1961)
●质子动力势的其他作用
●线粒体能量转换过程
细胞色素氧化酶(标志酶), ATP合酶, 肉毒碱酰基转移酶, 丙酮酸氧化酶。 功 能: 电子传递, 氧化磷酸化, 代谢物质运输。 另外还有：运输酶类（代谢、中间产物）， 运载体（磷酸、钙离子，核苷酸，谷氨酸 等），合成酶 类（DNA、RNA和蛋白质）
3. 膜间隙 主要酶类: 腺苷酸激酶 (标志酶) ，核苷酸 激酶， 二磷酸激酶 ，单磷酸激酶。 功能: 核苷的磷酸化。
目，频繁的融合与分裂可能是线粒体间共享遗传信息 的重要途径。
（二）线粒体融合与分裂 的分子及细胞生物学基础 1、线粒体融合与分裂 的分子生物学基础 线粒体融合与分裂均依赖于特定的基因和蛋白
质的调控。调控线粒体融合的基因最早发现于果蝇，
取名为Fzo（fuzzy onion,模糊 的葱头），决定果蝇 精细胞线粒体融合的基因（Fzo）编码一个跨膜 的 GTPase大分子，定位于线粒体外膜上，介导线粒体 融合。