青霉素生产工艺 (1)

青霉素生产工艺摘要：青霉素是人类最早发现的一种极其重要的抗生素,其杀伤革兰氏阳性细菌的神奇功效在二战中挽救了众多士兵的生命。

它的发现对药物学乃至整个人类发展的重要意义。

本文将对青霉素的生产工艺及其提取进行深入的讲解。

关键词：青霉素生产工艺发酵提取一、青霉素的生物学特性青霉素类抗生素是β-内酰胺类中1种,在分类上属于A类，酶的活性位点上有丝氨酸，又称活性位点丝氨酸酶，其作用机制是水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环，使抗生素失去活性。

由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。

青霉素G有钾盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。

二、青霉素的发酵青霉素的发酵生产的一般工艺流程：青霉素生产菌不同，发酵工业也有区别。

丝状菌的青霉素发酵工艺流程：沙土管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～7d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，6～7d）→种子罐（种子培养，25℃，40～45h）→繁殖罐（种子培养，25℃，13～15h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐球状菌的青霉素发酵工艺流程：冷冻管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～8d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，8～10d）→种子罐（种子培养，28℃，50～60h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐青霉素的分批发酵分为菌丝生长和产物合成两个阶段，进入合成阶段的必要条件是降低菌丝的生长速率。

影响青霉素发酵产率的因素有环境和生理因素两个方面，前者包括温度、PH、培养基种类及浓度、溶解氧饱和度等；后者包括菌体浓度、菌体生长速率、菌丝形态等。

菌体生长和青霉素合成最适温度并不相同，一般前阶段略高于后阶段。

因此，在菌体生长阶段可以采取较高温度，以缩短生长时间，而到达产物合成阶段，应适当降低温度，以利于青霉素的合成。

青霉素发酵的最适PH一般在左右，由于青霉素在碱性条件下不稳定，容易发生水解，因此应尽量避免PH超过。

三、青霉素发酵过程控制反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。

带放量10％，发酵时间24h。

发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。

在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。

所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。

（1）培养基青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。

葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。

碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。

经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。

葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。

通常采用葡萄糖和乳糖。

发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。

当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。

可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。

目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。

降低成本。

氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。

玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。

补加无机氮源。

无机盐：硫、磷、镁、钾等。

铁有毒，控制在30μg/ml以下。

流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。

残糖在％左右，pH 开始升高时加糖。

补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮%。

添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。

也具有刺激青霉素合成作用。

但浓度大于％时对细胞和合成有毒性。

还能被细胞氧化。

策略是流加低浓度前体，一次加入量低于%，保持供应速率略大于生物合成的需要。

（2）温度一生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。

但20℃青霉素破坏少，周期很长。

生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。

前期控制25－26℃左右，后期降温控制23℃。

过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。

有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。

（3）pH合成的适宜－左右，避免超过，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。

缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。

pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。

前期pH控制在~，中后期pH控制~，通过补加氨水进行调节。

pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提高通气量。

pH上升时，加糖或天然油脂。

一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。

（4）溶氧溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，则造成不可逆的损害。

所以不能低于30％饱和溶氧浓度。

通气比一般为1：。

溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。

适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。

（5）菌丝生长速度与形态、浓度对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。

在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。

另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。

（6）消沫发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。

天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。

少量多次。

不适在前期多加入，影响呼吸代谢。

四、青霉素的提取青霉素提纯工艺流程简图：青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。

1.发酵液预处理发酵液放罐后，首先要冷却，因为青霉素在低温时比较稳定，细菌繁殖也比较慢，可避免青霉素迅速被破坏。

青霉素菌丝教粗，一般过滤较容易，通常采用鼓式过滤及板框过滤；蛋白质的处理方法包括等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、凝聚剂沉淀、絮凝剂沉淀；吸附、酶解法去除不溶性多糖等；高价金属离子的去除方法有离子交换法和沉淀法等。

2. 过滤发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。

青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。

（1）菌丝体粗长10μm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。

滤液，蛋白质含量。

需要进一步除去蛋白质。

（2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节，加入%溴代十五烷吡啶PPB，%硅藻土为助滤剂。

再通过板框式过滤机。

滤液澄清透明，进行萃取。

3. 萃取青霉素的提取采用溶媒萃取法。

青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。

利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。

选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。

工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。

萃取2－3次。

从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择。

发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为，即一次浓缩倍数为。

为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。

发酵液与溶剂比例为3－4。

几次萃取后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。

萃取总收率在85％左右。

所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调~，加入醋酸丁酯，用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调~。

在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。

第一次萃取，存在蛋白质，加乳化剂PPB。

萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行（10 ℃以下）。

萃取罐冷冻盐水冷却。

4. 脱色萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。

5. 结晶萃取液一般通过结晶提纯。

青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。

然后采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于KOH溶液，调pH至中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。

直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。

加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素钾盐。

共沸蒸馏结晶：萃取液，再用M NaOH萃取，下得到钠盐水浓缩液。

加倍体积丁醇，16－26℃，下蒸馏。

水和丁醇形成共沸物而蒸出。

钠盐结晶析出。

结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。

五、抗生素的精制1、浓缩在抗生素提取和精制的过程中，常需要通过蒸发将发酵滤液或提取液进一步浓缩，以利于后序操作。

抗生素生产中有真空浓缩和薄膜蒸发浓缩。

2、干燥干燥的目的是除去抗生素中所含的水分，以提高产品的稳定性，有利于产品的加工、储存和使用。

常用的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、气流干燥、冷冻干燥等。

此外也有使用常压干燥、固定床干燥及红外线干燥等。

3、脱色和去热原提炼往往是注射用抗生素提取中不可缺少的一个单元操作。

这一步操作的好坏，不仅影响下一道工序，更重要的是关系到成品的色极及热原试验等质量指标。

用活性碳可除去各种色素，同时也能出去热原。

4、结晶抗生素的精制过程中常常通过结晶的方法来制得较高纯度的成品。

抗生素的精制方法很多，生产中常用的结晶方法有以下几种：改变温度结晶、利用等电点结晶、加成盐剂结晶、加入不同溶剂结晶、共沸结晶。

另外还有盐析法、中间盐转移法、晶体洗涤法等几种精制方法。

重结晶是进一步提纯精制抗生素的有效方法，通过重结晶方法可获得高纯度抗生素产品。

六、结论发酵罐是现代微生物发酵技术的象征，它是微生物在发酵过程中生长、繁殖和形成产品的外部环境装置，它取代了传统的发酵容器：培养瓶、酱缸和酒窖，它能实现大规模的生产，最大限度地利用原料和设备，获得高产量和高效率。

对青霉素生产的改进得益于来自于生物化学、遗传学、微生物生理学以及生化工程等方面科技人员的共同努力。

迄今为止，人们对青霉素生物合成的了解还十分肤浅，大部分机理仍还无法阐述清楚，然而可以预计，随着对青霉素发酵过程和代谢途径认识的不断深入，人们一定能够找到某种适当的办法来解决青霉素合成中的阻遏因素，从而大幅度提高青霉素的效价和产量。