细胞培养常见问题
细胞常见问题
1.血清中可能出现的沉淀物是什么？基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物：：（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到1-2mm，可以用肉眼观察到。
因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过最后的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。
（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。
这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。
他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。
2.血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？（1）细胞生长，我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养，我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。
（2）过滤，如果血清中出现大量的沉淀物，血清将很难过滤。
一般说来，因为在血清生产时最后已经经过100nm或者40nm的过滤处理，并且经过了严格的无菌检测，因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。
在实验室中没有必要再过滤处理血清，在大规模的细胞培养中往往将血清直接加到培养基中一起过滤。
（3）污染，磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端。
研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀，因此就会比较警觉的去做无菌试验，将血清放在培养箱中培养几天，结果可能会观察到更多的絮状沉淀，因此就断定血清被污染了。
并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点，因此就更加确认是血清被污染了。
于是，研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认，但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。
为了避免这些问题的发生，我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌，而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。
另外，也可以进行革兰氏染色，在油镜下观察，以确认是否有污染。
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
细胞实验中常见问题
细胞实验中常见问题
一、细胞培养问题
1.1 细胞生长缓慢或停止生长：可能原因是营养物质不足、血清质量不佳、培养箱温度不稳定或CO2浓度不正确等。
1.2 细胞形态异常：可能是由于培养基问题、营养不足、感染或污染等原因。
1.3 细胞结块：可能是由于细胞密度过大或血清用量过多等原因。
二、细胞活性检测问题
2.1 实验结果不一致或不准确：可能是由于试剂问题、操作误差或实验条件不稳定等原因。
2.2 假阳性或假阴性结果：可能是由于抗体交叉反应、实验操作不当或细胞状态不佳等原因。
三、细胞转染问题
3.1 转染效率低：可能是由于转染方法不正确、转染试剂选择不当或细胞状态不佳等原因。
3.2 细胞毒性：可能是由于转染试剂用量过多或转染条件不适应等原因。
四、细胞计数与消化问题
4.1 细胞黏附性强，不易消化：可能是由于细胞类型或状态不适应于消化方法等原因
4.2 细胞碎片多，影响计数：可能是由于消化过度或消化不充分等原因。
五、细胞标记与染色问题
5.1 染色不均匀或不显色：可能是由于染色时间过短或过长、抗体浓度不当或细胞状态不佳等原因。
5.2 非特异性染色问题：可能是由于抗体交叉反应或抗体纯度不佳等原因。
六、细胞分型与鉴定问题
6.1 分型结果不准确：可能是由于抗体选择不当、操作误差或细胞状态不稳定等原因。
6.2 鉴别困难：可能是由于细胞分化程度高、抗原表达量低或鉴别方法不敏感等原因。
七、细胞感染与病毒问题
7.1 细菌污染：可能是由于培养基或细胞株本身带菌等原因。
7.2 支原体污染：可能是由于培养环境不洁净、操作过程中污染等原因。
细胞培养中的常见问题解决方法
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养技术中的常见问题解答
细胞培养技术中的常见问题解答细胞培养技术是生物科学领域中重要的研究方法之一，广泛应用于细胞生物学、生物医学研究、药物开发等领域。
然而，细胞培养过程中常会遇到各种问题，这些问题的解答对于保证实验结果的可靠性和研究顺利进行至关重要。
本文将就细胞培养技术中的常见问题进行解答，希望对于读者在实验过程中的疑问起到一定的帮助。
Q1：为什么我的细胞无法附着在培养皿上？A：细胞无法附着的原因可能有多种。
首先，确保培养皿表面已经充分涂上了适当的基质，如凝胶体或胶原蛋白等。
其次，检查培养基的配方是否正确，是否缺乏必需的生长因子或氨基酸等。
同时，培养环境的温度、湿度和培养皿表面的处理都会影响细胞附着。
最后，细胞密度和接种时间也会影响细胞的附着能力。
如果问题仍然存在，可以尝试不同的培养条件以找到合适的附着条件。
Q2：为什么我的细胞生长缓慢？A：细胞生长缓慢可能源于多种因素。
一方面，细胞培养基的配方可能导致细胞生长受到限制。
检查培养基中是否缺乏必需的营养物质，如葡萄糖、氨基酸等，并根据需要进行调整。
另一方面，细胞密度过高或过低也会影响细胞生长速度。
合理调整细胞密度以促进正常的生长。
此外，温度、CO2浓度、培养皿和培养箱的湿度等因素也会对细胞生长产生影响。
对这些条件进行优化，在适当的环境中培养细胞可以加快其生长速度。
Q3：我应该什么时候更换培养基？A：细胞生长到饱和状态之前应避免更换培养基。
通常，在细胞取代率达到80-90%时，即到达细胞生长的最佳时机进行培养基的更换。
更换培养基的目的是为了提供充足的营养物质和清除废弃物，以促进细胞的生长和健康。
然而，过于频繁的培养基更换也会带来损害细胞的风险，因此要根据实验的需要和细胞的生长状态来进行判断。
Q4：细胞是否可以冻存？A：冻存细胞是细胞培养技术中常见的方法之一。
冻存细胞可以长期保存，以备将来的培养和实验使用。
冻存细胞需要使用特定的冻存液来保护细胞，并通过特定的冷冻和解冻过程来确保细胞的完整性和生存率。
细胞培养常见问题及其解决
细胞培养常见问题及其解决1、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。
细胞培养中常见的问题
细胞培养中常见的问题2006-11-23 15:53细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。
好像是细胞碎片一样。
是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。
我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。
我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。
但是，是什么东西不清楚。
的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。
长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。
而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。
不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。
以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。
那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。
我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。
国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。
但是并不影响细胞生长。
应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。
每周都会做清洁，用0。
2%新洁尔灭消毒，照紫外。
实验前也会照至少30分钟。
培养基中加青霉素，链霉素。
可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。
用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。
细胞培养技术常见问题解答
细胞培养技术常见问题解答细胞培养基础问答1. BHK细胞就是指BHK21吗？答：BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。
原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。
1963年获得单细胞克隆细胞。
后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。
最常用的是BHK21的一个亚克隆细胞，即克隆13或C13 。
2. 二倍体细胞有什么特点？答：二倍体细胞的染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；一般可传代培养50代；无致瘤性。
如W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。
MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。
3. 什么是动物细胞大规模培养？答：所谓动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，细胞培养技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器（Bioreactor）进行大规模细胞培养。
4. 细胞体内外培养的差别是什么？答：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
细胞培养中的常见问题及解决方法
细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一，可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。
然而，细胞培养过程中常常会出现一些问题，如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。
本文将讨论细胞培养中的这些常见问题，并提出相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。
它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。
细胞污染会影响实验结果的准确性，并可能导致细胞系的丢失。
为了解决这个问题，我们可以采取以下措施：（1）经常检查细胞培养器具和培养基，确保其无菌；（2）使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理，以减少污染的风险；（3）定期进行污染检测，例如细胞培养液和工作区的表面。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分，但在细胞培养中，过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。
为了减少细胞凋亡的发生，我们可以考虑以下措施：（1）优化培养条件，包括温度、CO2浓度和培养基配方等；（2）定期检查细胞形态和健康状况，及时处理出现凋亡现象的细胞；（3）使用细胞凋亡检测工具，如Annexin V-FITC/PI染色法，来评估细胞凋亡水平。
3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生，可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。
为了避免细胞失活的发生，我们可以尝试以下方法：（1）及时更换培养基，确保细胞获得充足的营养物质；（2）避免过度培养，及时传代细胞；（3）定期鉴定细胞的纯度和活力，并确保培养条件适当；（4）尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。
细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个，还有其他一些问题，例如细胞出现突变、细胞凝固等。
针对这些问题，我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。
同时，注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。
细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。
了解并解决细胞培养中的常见问题，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。
通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择，我们可以克服这些问题，为细胞培养研究的进展做出贡献。
细胞培养的常见问题
关于液体培养基保存温度
●液体培养基可以放-20℃保持吗？
答：不可以！因为在-20℃下，培养基中的盐容易析出， 培养基融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致 培养基渗透压降低，培养细胞时，细胞容易破裂而死 亡。
●我自己新配制的液体培养基可以存放多久？
答：我们建议将新配制的培养基放置于4℃，避光保存 尽量在一周内使用完毕。培养基越新鲜越好。
经典培养基介绍
● BME（Basal Medium Eagle) 由Eagle发明，只有11种氨基酸和盐及一些维生素的最简单培养 基。最先用于培养小鼠的L细胞和人类的HeLa细胞，现在广泛应用 于各种细胞的培养。
● EMEM or MEM（Eagle’s Minimum Essential Medium) BME的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞。
●培养用液渗透压是怎样影响细胞生长的？
答：当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压。这种情 况下，水分通过渗透流入或流出细胞，从而改变细胞的内环 境。高渗透压迫使水分从细胞中扩散出来导致细胞收缩，这种 情况会使DNA和蛋白遭到破坏，细胞周期停滞以及最终使细胞 死亡；反之，低渗透压使水分流入细胞内，使细胞肿胀破裂。
● RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute #1640) McCoy’s 5A的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培 养。如人类白细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞等血液来源的细胞。
● Ham’s F10（Ham’s Nutrient Mixture F10) 由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。
◆不含血清，蛋白，水解物，酯类等 ◆无血清/无蛋白培养基也可能不含
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养常见问题的原因及对策
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
细胞培养教学中的常见问题及应对措施教育文档
细胞培养教学中的常见问题及应对措施细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术, 是生命科学工作者必备的实验技能。
细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种因素的影响[1] 。
在多年的教学实践中, 笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直接影响到教学的顺利进行, 针对这些问题,笔者采取了一些应对措施, 取得了较好的效果。
1 细胞培养教学中的一些常见问题1.1培养的细胞易被污染离体培养的细胞没有抗感染能力, 因此防止污染是细胞培养成败的关键。
笔者在教学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。
1.2细胞培养对操作环境要求高, 不易组织教学细胞培养需要在无菌室的超净台中进行, 空间较小, 教师无法面对大量的学生进行实验示教, 因此在组织教学上有一定的困难。
1.3实验过程较长, 操作步骤多, 不易监控细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多, 实验过程长操作步骤多。
进行一轮完整的实验, 往往需数天时间, 而且在实验过程中, 学生来做实验的时间不固定, 因此教师不容易对学生的实验全过程进行监控。
1.4实验评价标准单一, 不适于这一类实验的教学以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据, 其缺陷是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术, 主要体现在实验的过程中。
笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重点实验室学习和进修, 虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术, 但其做细胞培养实验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。
笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验教学的问题, 综合这些经验, 提出了相应的处理对策。
2 应对措施2.1完善细胞培养室设施, 规范实验操作步骤2.1.1细胞培养室应单独隔离出来专用, 能建立一定清洁级别的培养室是最好的, 考虑到用于教学的实验室需要较大的面积, 可能不易达到这样的清洁级别要求, 但至少要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2] 。
细胞培养技术及常见问题
六、细胞的冻存和复苏 1、冻存 • 冻存液 7份培养液、2份FBS、1份DMSO或甘 油。 • 细胞密度 （1~10）×106个/ml • 步骤 4℃30分钟→-80 ℃24小时→液氮 • 冻存细胞应选取处于对数生长期的细胞。 2、复苏 • 液氮中取出的细胞应马上放入37 ℃水浴中，快 速摇晃融化。 • 0.4%台盼蓝染色，检测细胞存活率。
次 ↓ 加0.8ml无血清培液至Lipofectin-DNA混合物中，混 匀，滴加在细胞上，轻轻混匀。 ↓
37℃，5%CO2培养箱内培养5~24小时 ↓ 弃去转染液，加入2ml完全培养基，继续培养 ↓ 转染48~72小时，测定细胞瞬时表达情况，或于 转染48小时后更换选择培养基，进行筛选，获得 稳转细胞
4、灌流法→血管内皮细胞、成年动物心肌细胞 培养 • 胰酶、胶原酶可以单独或混合使用 5、密度梯度离心法→淋巴细胞、单核细胞培养 • Ficoll • Percoll 可以得到较纯的单核细胞 • 分离液成分为多糖复合物，可能与细胞表面受 体结合，影响后续实验结果。
※如何收集细胞进行实验检测
1、应该选用处于对数生长期，状态良好的细胞 用于实验。 2、细胞应处于70%左右融合，形态饱满，折光性 好。提前24小时换无血清培养基，避免血清 干扰，控制细胞生长速度。 3、选择适当的分离液，避免所分离的细胞表面 受体和其他标记分子被遮盖。 4、酚红有类似雌激素作用，为避免类固醇反应， 某些检测使用的细胞要用不加酚红的培养基。
2、污染的排除 • 及时高压灭菌污染的细胞，然后丢弃。（首选） • 对于污染较轻，且来源困难的高价值细胞
（1）用无抗培养基传代细胞，接种于多孔板中 （2）将浓度梯度稀释后的抗生素加入孔内，例如，两性 霉素B推荐下列浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、 8.0mg/ml。 （3）每天观察细胞毒性指标，如脱落、空泡、变圆等。 （4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2~3倍 浓度的抗生素培养液培养细胞2~3代。 （5）在无抗培养基中传代一次。 （6）重复步骤4 （7）在无抗培养基中培养4~6代，确定污染已被消除。
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考细胞培养是生物学和医学研究中非常重要的一项技术。
然而，在进行细胞培养过程中，我们常常会遇到一些问题。
本文将介绍几个细胞培养中常见的问题，并提供相应的解决方法参考。
1. 细胞污染问题细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能来源于细胞培养器皿、培养基、试剂、液体气氛等多个方面。
常见的细胞污染类型包括细菌、真菌、酵母菌、支原体、霉菌等。
遇到细胞污染问题时，可以采取以下解决方法参考：- 严格的无菌操作：所有实验应该在无菌条件下进行，使用经过验收的培养器皿和无菌试剂。
- 经常检查和更换培养器皿、培养基：经常检查培养器皿和培养基是否有异常情况，如有污染应及时更换。
- 预防细胞污染：定期进行表面消毒、培养器具灭菌和试剂消毒以预防其他污染来源。
2. 细胞生长问题细胞生长问题是细胞培养过程中常见的一个问题。
主要表现为细胞无法黏附、生长缓慢或停止生长。
解决细胞生长问题的方法参考如下：- 增加培养物中的营养物：根据细胞类型和需求，调整培养基中的蛋白质、维生素和氨基酸等营养物的浓度。
- 提供适宜的培养条件：调整温度、湿度、CO2浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
- 检查细胞的健康状态：定期检查细胞的形态和健康状况，如发现异常应及时采取措施。
3. 细胞凋亡问题细胞凋亡在细胞培养中可能出现，特别是在长期培养过程中。
细胞凋亡表现为细胞收缩、核染色质浓缩、DNA断裂等特点。
以下是解决细胞凋亡问题的方法参考：- 优化培养条件：提供适宜的培养基、温度、CO2浓度、液面高度等环境因素。
- 增加细胞存活因子：添加适量的生长因子、细胞因子或激素等，以提高细胞存活率。
- 检查细胞状态和健康：及时观察细胞的形态和生长状态，发现异常情况及时处理。
4. 细胞分化问题在一些特定细胞系中，细胞分化可能成为一个问题。
细胞分化表现为细胞形态、生长速率、分泌物或细胞功能的改变。
以下是解决细胞分化问题的方法参考：- 控制培养时间：在合适的时间段内收获细胞，以避免细胞进一步分化。
细胞培养过程中可能出现的问题及其解决方法
细胞培养过程中的常见问题及其解决方法一、培养液pH 值变化太快可能原因：1、CO2 张力不对；2、培养瓶盖拧得太紧；3、NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足；4、培养液中盐浓度不正确；5、细菌、酵母或真菌污染。
解决方法：1、（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％到10％。
（2）改用不依赖CO2 培养液。
2、松开瓶盖1/4 圈。
3、加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
4、在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
5、丢弃培养物或用抗生素除菌。
二、培养液出现沉淀，但pH值不变解决方法：1、用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。
冰冻保存培养液。
2、用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。
3、将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
三、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化原因：细菌或真菌污染解决方法：丢弃培养物。
或用抗生素除菌。
四、培养细胞不贴壁原因：1、胰蛋白酶消化过度；2、支原体污染；3、培养液中无贴壁因子。
解决方法：1、缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
2、分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培物。
五、悬浮细胞成簇原因：1、培养液中含钙、镁离子；2、支原体污染；3、蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA。
解决方法：1、用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
2、分离培养物，检测支原体。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
3、用DNase I 处理细胞。
六、培养细胞死亡原因：1、培养箱内无CO2；2、培养箱内温度波动太大；3、细胞冻存或复苏过程中损伤；4、培养液渗透压不正确；5、培养液种有毒代谢产物堆积。
解决方法：1、检测培养箱内CO2；2、检查培养箱内温度；3、取新的保存细胞种；4、检测培养液渗透压，注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg；5、加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压；6、换入新鲜培养液。
细胞培养-Protocol
细胞培养是一项常用的生物技术，其原理是基于细胞在适当的培养条件下能够维持存活和增殖的能力。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞样本，用于研究、药物筛选、疾病治疗等应用。
以下是细胞培养的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、原理细胞培养的基本原理是模拟细胞在生物体内的生长环境，提供细胞生存和增殖所需的基本条件。
这些条件包括适当的温度、湿度、营养物质（如氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等）和气体环境（如氧气、二氧化碳等）。
通过提供这些适宜的条件，细胞可以在体外环境中维持生存和增殖。
细胞培养中涉及的关键生物学过程包括细胞的贴壁、增殖和传代。
细胞的贴壁是指细胞在培养瓶内附着于瓶壁上的过程，这通常发生在细胞悬液加入培养液之后。
细胞贴壁后，会开始进行有丝分裂，进行增殖生长。
当细胞数量增加到一定程度时，需要将培养瓶中的细胞传代到新的培养瓶中，以维持细胞的适宜生长密度。
二、所需试剂和耗材细胞培养所需的主要试剂和耗材包括：1.培养基：为细胞提供基本的营养物质，如胎牛血清、氨基酸、葡萄糖等。
2.添加剂：包括抗生素、抗真菌药物等，用于防止培养过程中的污染。
3.培养瓶：用于细胞的培养，有不同的规格和形状。
4.移液器：用于吸取和转移细胞悬液和培养液。
5.离心管：用于离心收集细胞。
6.过滤器：用于过滤培养液中的杂质和颗粒。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
8.无菌操作台：用于进行无菌操作，防止污染。
三、实验仪器细胞培养常用的实验仪器包括：1.细胞计数器：用于细胞计数和细胞密度测量。
2.显微镜：观察细胞的生长情况和形态变化。
3.CO2培养箱：为细胞提供适宜的生长温度和气体环境。
4.高压灭菌器：用于消毒处理实验器材和试剂。
5.超净工作台：用于进行无菌操作。
6.分光光度计：用于测量细胞生长的生化指标，如蛋白质含量等。
四、准备工作在进行细胞培养前，需要进行以下准备工作：1.选择适当的细胞：根据实验需求选择适合的细胞，了解其特性、来源和培养条件。
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问题1：培养液pH 值变化太快可能原因（1）CO2 张力不对（2）培养瓶盖拧得太紧（3）NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足（4）培养液中盐浓度不正确（5）细菌、酵母或真菌污染建议解决方法（1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％到10％。
（2）松开瓶盖1/4 圈。
（3）改用不依赖CO2 培养液。
加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。
（4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。
（5）丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因（1）洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来（2）冰冻保存培养液建议解决方法（1）用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
（2）将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH 发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因（1）胰蛋白酶消化过度（2）支原体污染（3）培养瓶瓶底不干净（4）培养液pH值过碱（NaHCO3分解）（5）消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当（6）细胞老化（如传代前细胞已汇合导致失去贴附性）（7）接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法（1）缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
（2）分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
（3）注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶（4）使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2（将培养液敞口放入培养箱也可）（5）重新配置消化液或培养液（6）启用新的保种细胞（7）调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因（1）培养液中含钙、镁离子（2）支原体污染（3）蛋白酶过度消化使得细胞裂解释（4）DNA污染建议解决方法（1）用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
（2）分离培养物，检测支原体。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
（3）用DNase I 处理细胞。
问题6：原代细胞培养物污染可能原因原代培养组织在进入培养前已污染建议解决方法培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
问题7：培养细胞生长减慢可能原因（1）由于更换不同培养液或血清（2）培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。
（3）培养物中有少量细菌或真菌污染（4）试剂保存不当（5）接种细胞起始浓度太低（6）细胞已老化（7）支原体污染建议解决方法（1）比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。
让细胞逐渐适应新培养液。
（2）换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
（3）用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。
或用抗生素除菌。
（4）血清需保存在-5℃到-20℃。
培养液需在2－8℃避光保存。
含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2 周内用完。
（5）增加接种细胞起始浓度。
（6）换用新的保种细胞。
（7）分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
问题8：培养细胞死亡可能原因（1）培养箱内无CO2（2）培养箱内温度波动太大（3）细胞冻存或复苏过程中损伤（4）培养液渗透压不正确（5）培养液种有毒代谢产物堆积（6）更多原因参考问题4和问题7建议解决方法（1）检测培养箱内CO2（2）检查培养箱内温度（3）取新的保存细胞种（4）检测培养液渗透压。
注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 – 350 mOsm/kg。
加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
（5）换入新鲜培养液（6）更多解决方法参考问题4和问题7培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI- 1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）2.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。
激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。
在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。
L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。
一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。
5.为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。
为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。
由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
6.如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。
轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。
活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7.如何消除组织培养的污染？重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。
首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA 过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。
这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤:1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。
在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。
例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6 重复步骤4。
7 在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。
8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。
尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。
这应该不会影响血清的质量。
推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。
原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。
碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。
Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。
如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。
如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
11.Qualified和Certified 胎牛血清有什么差别?Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。
EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。
建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
13.制备lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？是的。
对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。
混合两种溶液在室温下孵育15分钟。
对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA 溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。
确保复合物在没有血清的情况下形成。
孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。
（注意以上是35mm 培养皿使用体积）。
对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。
LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。
对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。
14.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。
在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。
在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。
为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。
15.如何检测内毒素(热源)水平？LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。
Levin 和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。