钙离子测定

用荧光测定法，通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。根据激发光的波长不同，可以将检测细胞内钙离子用的荧光染料分为紫外光激发的钙离子荧光指示剂和可见光激发的钙离子荧光指示剂。其中，紫外光激发的钙离子荧光指示剂有Fura 2、lndo-1、Bis-fura、Ouin-2、Fura-4 F、Fura-5F、Fura-6F、Benzothiaza-1、Benzoth．

Iaza-2、BTC等；可见光激发的钙离子荧光指示剂有FIno-3、Fluo-4、Fluo-5N、Rhod-5N、X-rhod-5N 、Calcium Green-1 、Calcium Green-2、Calcium Orange、Calcium Crimson、Fura Red等。Fluo-3具有Kd值较高、可见光激发、监测背景低等优点，被广泛用于荧光监测的指示剂[9]。Fluo-3/AM在与钙结合后表现为荧光强度的增加，细胞内钙离子浓度愈高，荧光愈强，细胞内钙离子浓度愈低，荧光愈弱[10]。以往测定细胞内钙离子浓度变化的方法通常是利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来完成，但缺点是LSCM扫描采集速度慢，对培养器皿要求特殊，且价格高昂，检测成本高，对细胞伤害大。为降低长时间采集对样品造成的损伤，作者应用高灵敏度的流式细胞仪和流式细胞技术相结合，以纯化的T淋巴细胞为研究对象，选择Fluo-3/AM负载细胞，成功获得了实时监测并分析受到外界信号刺激时细胞内Ca2+

浓度的动态变化。结果显示随着刺激信号的加入和时间的变化，Fluo-3/AM负载的T淋巴细胞内的钙离子浓度呈现动态变化。该方法能简单快速、可直接动态实时检测细胞内钙离子荧光信号，为研究细胞内的Ca2+浓度的动态变化提供了实用的解决方案和方法。

水母发光蛋白（ＡＥＱ）广泛应用于Ｃａ２＋信号监测领域己有近４０年。ＡＥＱ是由一个２２ＫＤａ大小的可结合Ｃａ２＋的脱辅基发光蛋白和辅基腔肠素（ＣＴＺ）组成的，在有

氧情况下，自发组成功能全蛋白，具有三个Ｃａ２＋结合手性位点。当有Ｃａ２＋结合后，ＡＥＱ会发生构象改变，发挥氧化酸功效，使腔肠素由常态转变为激发态并释放Ｃ０２。激发态的腔肠素回到基态时会释放波长为４６９ｎｍ的蓝光［６９］。通过光度计对光强的检测进而得知相应的Ｃａ２＋浓度。利用遗传编辑和克隆等手段，在编码ＡＥＱ的序列前加上一段靴向氨基酸序列，使得ＡＥＱ在特定组织或细胞中表达［７０］。随着研究的深入，使得ＡＥＱ可以在细菌、酵母、真菌、植物、动物细胞中进行内源性表达，能够对Ｃａ２＋的变化进行实时以及特定空间的监测［７１＿７３］。ＡＥＱ最突出的优点就是通过添加信号肽序列可以使其做到亚细胞定位，利用重组的ＡＥＱ可以研究不同细胞器间Ｃａ信号的相互作用［７４７９］。但是ＡＥＱ也有缺陷：自发光信号。尽管由细胞群体发出的信号可以完全覆盖其自身信号，但是单个细胞的信号是很弱的，几乎无法排除ＡＥＱ的干扰。因此，ＡＥＱ的应用便有了局限性。

１．２．４．２基于绿色荧光蛋白的耗离子指示剂

早在１９９７年绿色焚光蛋白（ＧＦＰ）便开始作为监测Ｃａ２＋的探针被应用于动、植物中目前，基于ＧＦＰ的Ｃａ２＋传感器主要有三种：ｃａｍｅｌｅｃｍｓ、ｃａｍｇａｒｏｏｓ和ｐｅｒｉｃａｍｓ［８２＿８４］。Ｃａｍｅｌｅｏｎｓ相比其它两种应用的更广泛些。所有这些传感器都是基于对齊调蛋白（ＣａＭ）的改造，Ｃａ２＋结合后改变ＣａＭ的构象进而改变焚光特性，最终引起焚光共振能量转移（ＦＲＥＴ）。ＦＲＥＴ反应发生在供体焚光蛋白和受体荧光蛋白之间，供体焚光蛋白的发射光谱和受体焚光蛋白的激发光谱之间有光谱重叠，两个焚光蛋白由ＣａＭ和ＣａＭ结合肽连接，当Ｃａ２＋与ＣａＭ结合后改变ＣａＭ构象，将两个焚光蛋白间的距离拉近到小于ｌＯｎｍ，在有外源激发光时，．发生ＦＲＥＴ反应。基于ＧＦＰ的Ｃａ２＋指示剂将Ｃａ２＋监测更细化到某一类细胞或某一个细胞、甚至是某一个细胞器中，并且更直观、实时的反映了Ｃａ２＋变化情况［８５＿９１】。

钙水母发光蛋白(aequ衍in)是一种从水母中分离出的发光蛋白,Mr为31kD,与Ca“+结合而被激活,发出蓝色荧光,在0.1~10pM范围内Ca“+荧光强度与Ca“十浓度呈正相关。发光反应不需要其它协同因素,不受N+a、+K、Mg“+等离子的干扰,灵敏度高,可测定nM~pM 的Ca“十浓度。目前,该方法已成功的应用于基因工程,可将克隆的水母发光蛋白基因以嵌合体的形式导入动、植物细胞,并在其中表达,解决了无伤害细胞外导入,还有可能进行植物整株各部分细胞CaZ十的测定。小分子荧光指示剂的使用更为广泛。利用荧光指示剂非损伤细胞来测胞内CaZ十的方法,结合激光扫描共聚焦显微技术(LaserseanningeonfoealMieroteehnieLSCM),为精确定位和测量活细胞的〔aCZ`]。y。时空分布及刺激条件下的动态变化提供了有利的显微研究手段。

幼叶细胞中Ca2+的细胞化学定位

Ca2+的细胞化学定位参考张红等（1994）的方法。各处理取枝条顶端幼叶3 片，用预冷的蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干。所用器具经过预冷，在冰浴上用双面刀片在叶片中脉两侧切取0.5 mm ×1.0 mm 大小的组织块，迅速投入用2%焦锑酸钾（p H 7.6）配制的3%戊二醛(先用0.1mol/L PH7.1 磷酸缓冲液配置2%焦锑酸钾)固定液中，室温下固定48h后（真空泵抽气15 min，待大部分叶块下沉后于25℃下固定1 h），再于4 ℃下固定4 h。然后用2%焦锑酸钾的磷酸钾缓冲液洗涤3次，每次0.5h，洗涤后，将材料转移至用2%焦锑酸钾（p H 7.6）配制的1% Os O4中，室温下固定3h后，（4 ℃下固定过夜）。固定完成后，先用重蒸水洗涤3次，再用PH10.0（用0.1mol/L的KOH调节PH）的重蒸水洗涤2次，每次0.5小时。漂洗后常规系列乙醇脱水30%、50%、70%、80%、90%、95%各0.5h，（丙酮置换3次，每次7-15min，）放入丙酮稀释的812环氧树脂（比例为3:1），在35度恒温箱