第五章-荧光分析法

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分子荧光分析法
二、分子发光的分类(按激发的模式 )
分
热致发光
荧光☆
子 光致发光
发 光
场致发光
磷光
化学发光
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分子荧光分析法
光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态 跃迁到激发态，处于激发态的分子发射出光的现象， 称为光致发光。最常见形式是荧光和磷光。
荧光分析法：根据物质的荧光光谱的特征及强度对 物质进行定性和定量分析的方法，称之为荧光分析 法。
激发三重态（根据自旋禁阻定律）。
➢ 电子处于激发态（不稳定状态），可通过无辐射跃迁和辐 射跃迁(发光)等方式失去能量，返回基态。
能量传递 途径
无辐射跃迁
辐射跃迁
振动弛豫 内转换 外转换 系间窜跃
荧光
磷光 7
无辐射方式传递途径
（1）振动弛豫
在同一电子能级 中，电子由高振动 能级转至低振动能 级，而将多余的能 量以无辐射形式放 出的过程。
由于（T1→S0）这个跃迁过程 也是自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为10-4-10s。因此，这 种跃迁所发射的光，在光照停 止后，仍可持续一段时间。
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振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
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二、 激发光谱与荧光光谱
4 3 2 1
S0
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
荧光光谱的特征 （重点） 1.斯托克斯位移(Stokes shift):
荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。
室温下菲的乙醇溶液荧光光谱
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2.荧光光谱与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波
长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子 激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从 而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱 的形状与激发波长无关。
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二、 激发光谱与荧光光谱
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荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长 的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固 定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激 发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横 坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光 谱。
注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光 谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则 是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。
振动弛豫时间: 10-12 秒数量级
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（2）内转换
当两个电子激发态之间的能级 非常靠近以至其振动能级有重叠时， 常发生电子由高能级以无辐射方式 转移至低能级的过程。
如右图，处于高激发态（S2）的电 子，通过内转换，转移到低激发态 （S1）的振动能级。
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（3）外转换
激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而 失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换使 荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。
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B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关：
分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；
即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降 到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800
注意：无论电子开始被激发至哪一个激 发单重态，经过振动弛豫及内转换，均 可回到第一激发单重态的最低振动能级， 然后再以辐射形式发射光而返回至基态 各振动能级上。
荧光的产生在10-7-10-9s内完成。
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（2）发射磷光
电子由第一激发单重态的最低 振动能级，以系间窜跃方式转 至第一激发三重态，再经三重 态最低振动能级返回至基态时 发射的光，称为磷光。
优点：灵敏度高；选择性好；试样用量少；方法简单。
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第一节 分子荧光分析法的基本原理（重点）
一、分子荧光的产生 1.分子的电子能级和激发过程
泡利不相容原理
自旋量子数：s = ½ 或-½
E
总自旋量子数：
s si
分子电子能级的多重性：
M 2s 1
单重态（S）：s=0，M=1，分子所处的电子能态。
三重态（T）：s=1，M=3，分子所处的电子能态。
光谱的镜像关系
4400 4000
固定lem=620nm(MAX)
1→ 4
固定lex=290nm (MAX)
1→4
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1 →3
2 1
2800
1→ 2
2400
1→2
2000
1600
1200 800
1→1
400
பைடு நூலகம்
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
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（4）系间窜跃
处于激发态分子的电子发生自 旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程。
如图，电子S1的振动能级同T1的振 动能级重叠，则可能发生体系间 跨越S1→T1 ，分子由激发单重态 跨越到激发三重态，荧光强度减 弱甚至熄灭。
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辐射方式传递途径
（1）发射荧光
物质分子吸收能量被激发后，从 激发单重态的最低振动能级返回 基态时发射出的光，称为荧光。
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2.荧光的产生
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态 分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为104 ~ 1s以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
电子能级的多重性：M=2s+1，s（总自旋量子数）
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2.荧光的产生
➢ 根据波兹曼分布，分子室温基本处于电子能级的基态，激 发时，基态电子只能跃迁到激发单重态，不能直接跃迁到
第05章 荧光分析法
本章学习目标： 1、掌握分子荧光分析法的基本原理和特点 2、掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度
的因素 3 、熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计
4 、了解分子荧光分析法的应用
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分子荧光分析法
一、什么是分子发光？
处于基态的分子吸收能量后，跃迁 到激发态，当激发态分子以发射光 的形式释放能量，返回基态的过程， 称为分子发光。