质粒dna的提取和鉴定
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。
质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。
提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。
本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。
实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。
2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。
步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。
2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。
步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。
不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。
2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。
3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。
不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。
4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。
步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。
2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。
11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。
12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。
步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。
2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。
质粒DNA的提取鉴定
六、实验报告要求
原理 操作 结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、名称、强弱、距离） 结果说明 思考题 分离提取DNA的过程中哪些因素会引起链的断裂? 本实验为了质粒DNA纯度和分子的完整性，采用了哪些措施？
五、琼脂糖凝胶电泳操作步骤
3. 加样：20ul TE + 3ul 上样缓冲液，取6ul 进行点样 4. 电泳： 电压：60V 电泳时间：0.5 h 电泳终止：指示剂距离凝胶前沿约1cm处 5.检测：取出胶板，用紫外检测仪观察结果。纯的质粒DNA只有超螺旋DNA一条带。 6.凝胶处理：鉴定后的凝胶应放在指定的地方，待干燥后烧毁，不能倒在垃圾中，以防EB污染。
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细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。
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二、实验原理
碱变性抽提法法是常用的方法之一.
此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。
在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
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二、实验原理
抽提中各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在： 1. 共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），常以超螺旋形式存在； 2. 开环DNA（open circular DNA，ocDNA），此种质 粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力，形成松弛的环状分子； 3. 线状DNA（linear DNA，lDNA），质粒DNA的两条 链在同一处断裂所形成。在电泳时，同一质粒DNA 的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环，线形 和超螺旋DNA。 cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA提取、鉴定
我们单独用酚抽提酚，会有大量的酚溶解到水相中， 而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因 此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去 除。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层 的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
离心 12000rpm 10 min ↓ ↘弃上清 沉淀干燥 ↓ 11. 加入TE 25-30ul,溶解沉淀 （反复吹打至 完全溶解）
质粒（plasmid）
存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在
宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。
与染色体ＤＮＡ相比，质粒结构简单，分子大小不
等。小的不到1.0×106道尔顿，大的则超过
200×106道尔顿。
质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功
能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨 卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细 菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞 一定的表型。
具备基因工程质粒载体的条件：
① 多克隆位点（multiple cloning site, MCS), 一段短 的序列上有多种限制性内切酶切口，每种只有一个 切口。 ② 选择性标记，如抗药性。
③ 本身分子量不宜过大，有一定容量。
④ 有一定的copy number —— 每个宿主菌可能容纳
的最多质粒数。
14.电泳
1. 制胶: 1% 2. 点样 （1）质粒提取液 5 ul + TE 15 ul （2）单酶切液 20 ul （3）双酶切液 20 ul 各加上样液溴酚兰 4-5 ul
（4）Marker 老师加 每小组（2人）3道，Marker 1道
marker DL 15000: 15000, 10000,7500,5000,2500,1000,250bp 上样液： 50％甘油、0.25M EDTA, 0.05%溴酚蓝，pH8.0
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒DNA的提取与鉴定
质粒DNA的提取与鉴定实验日期 2020.5.14 室温 25℃成绩实验报告摘要实验目的：①掌握质粒提取原理和各种试剂的使用②掌握琼脂糖凝胶电泳原理和方法实验方法：琼脂糖凝胶电泳法实验结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图获得三条带，从近到远分别为开环状DNA；线状DNA；超螺旋状DNA实验结论：碱性裂解法可以从大肠埃希菌中提取到质粒DNA实验原理1、质粒是独立存在于染色体，能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。
2、细菌质粒是应用最多的质粒群体，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA。
3、对数期菌体：具有质粒的大肠埃希菌。
4、溶液 I 充分重悬：50 mmol／L 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
25 mmol／L Tris-HC1(pH 8.0) ：维持PH。
10 mmol／L EDTA(pH 8.0)：二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子,抑制DNA酶的活性。
5、溶液II裂解：0.2 mol／L NaOH:主要作用溶解细胞，释放DNA；l％ SDS:阴离子去垢剂。
作用：既能裂解细菌细胞膜，又能使细菌蛋白质变性。
质粒DNA具有特定的形态结构，在特殊环境下，如加热、极端PH等，能变性。
SDS处理细菌细胞能导致细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA和细菌基因组DNA。
6、溶液III中和：5 mol／L 醋酸钾：使钾离子置换SDS中的钠离子，形成PDS（十二烷基硫酸钾）。
因为SDS遇到钾离子后变成PDS，而PDS是不溶于水，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。
冰乙酸：中和NaOH。
去除变性条件后，质粒DNA能复性，在加入强碱NaOH后，通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液，质粒DNA便能迅速复性。
需要注意，染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性，所以，离心后，能将质粒DNA留在上清中，染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告(2020年整理).pptx
实验一、质粒 DNA 的提取及检测
【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术 3、学会 PCR 操作的基本技术
第一部分 质粒DNA 的提取
一、实验原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差
二、仪器与试剂 1、仪器 恒温摇床、台式离心机 2、试剂 溶液 I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE 缓冲液、胰 RNA 酶、酚、氯仿
三、实验步骤 1、 将 2mL 含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的 LB 液体培养基加入到试管中，接入含 pUC19
质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2、 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管中，4000r/min 离心 2min。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10 min。 5、 加 200μL 溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上 5min。 6、 加入 150μL 溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置 15min。 7、 12000r/min，离心 15min，将上清转至另一离心管中。 8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心 5min，
变性
94℃
45s
退火
56℃
45s
延伸
72℃
45s
完全延伸
72℃
3min
（3）PCR 结束后，取 10μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带。
第三部分 PCR 扩增制备目的基因
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂，使细胞溶解。
5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。
2.将上清液倒出，保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒DNA的提取和鉴定
质粒DNA的提取和鉴定背景资料如下：质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
实验的准备：一、器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二、试剂LB液体培养基（100ml），2个三角瓶√50ml离心管10ml离心管1.溶液Ⅰ√（右冰箱上层）50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0（50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2 ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）（右冰箱下层）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取和鉴定
五、注意事项——材料准备
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增 加）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失
➢ 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加 大菌体用量
➢ 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
➢ 菌体量适当。
➢ 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
策
使用浓度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
六、质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
三、实验仪器、材料与试剂
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机 相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇 有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： ▪ 溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM EDTA
作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 ▪ 溶液II 0.2N NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。 ▪ 溶液III 5M KAC
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质 的方法
质粒DNA的提取及检测实验报告
四川大学实验报告题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
噬菌体、M133.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性1 / 9四川大学实验报告（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。
提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。
鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。
根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。
同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。
通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
质粒DNA的提取和鉴定
该技术通常具有快速、高效的特 性，能在短时间内处理大量样本。
高通量质粒DNA提取技术可以提 供标准化的操作流程，确保提取 的一致性和准确性。
质粒DNA的测序技术
下一代测序
质粒DNA的测序技术已发展到下一代测序 阶段，能够快速、准确地测定质粒DNA的 全序列。
深度覆盖
通过深度覆盖测序，可以获得质粒DNA更全面的序 列信息，有助于发现稀有变异和基因组结构变异。
注意事项
凝胶电泳检测质粒DNA时，需要注意电泳条件的选择，如电压、电流和时间等，以确保 分离效果最佳。同时，需要使用已知大小的DNA片段作为标准进行对比分析。
紫外分光光度法检测质粒DNA
01
原理
紫外分光光度法是通过测量物质在特定波长下的吸光度来分析物质浓度
的方法。质粒DNA在260nm波长下有最大吸收峰，通过测量吸光度可
基因组编辑
质粒DNA可以作为CRISPR-Cas9等基因组编辑技术的辅助工具，用于向细胞提 供指导编辑的RNA和Cas蛋白。通过将质粒导入细胞，可以实现对特定基因的敲 除、敲入或突变。
在生物技术和生物工程中的应用
生物制药
质粒DNA常被用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素 等。通过在大规模细胞培养物中转染质粒，可以高效地生产 这些药物。
质粒DNA提取的注意事项
保证细菌的活性和纯度
在提取前应确保细菌处于对数生长期，并去除杂质和死细胞。
避免交叉污染
整个操作过程需在无菌条件下进行，并确保使用的工具和试剂无菌。
保证质粒的完整性
提取过程中应避免质粒断裂或降解，以确保后续实验的准确性。
02
质粒DNA的纯化
离心法纯化质粒DNA
原理
通过高速离心将质粒DNA与细 胞碎片、蛋白质等杂质分离，
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新鲜配制）
❖ 溶液Ⅰ—溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶。
❖ 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH， 1% SDS。
M pBSK pGFP
质粒DNA提取常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1. 菌体老化 2. 碱裂解不充分 3. 菌体中无质粒 4. 溶液使用不当
1. 请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养
2. 可减少菌体用量或增加溶液 的用量
对
3. 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素
原理示意图
质粒DNA电泳
电场中DNA分子的迁移速度取决于： ❖ DNA分子本身的大小 ❖ DNA分子的空间构型
超螺旋构型（ccDNA) 线形DNA(lDNA) 开链环状DNA(ocDNA) 复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)
•溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核 酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙 色荧光
培养3-4小时（OD600＝1.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 ℃离心30
秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并 重复一次，弃上清，取沉淀。
步骤二 质粒提取
1. 取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm， 4℃，离心30sec，弃上清。
9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 ℃离心2分钟。
10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置 5min。室温放置15min干燥。
11．50µl TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存）
12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼 脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
Attention, please!
❖ EB是强诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将 该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！
质粒提取实验材料与试剂
❖ 实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a ❖ 实验试剂：
LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL （pH8.0）、1mM EDTA、Amp 50mg/ml、酚、 氯仿、Rnase、琼脂糖
分离质粒DNA的 基本步骤
❖ 培养细菌使质粒扩增； ❖ 收集和裂解细菌； ❖ 分离和纯化质粒DNA
质粒DNA的提取方法
❖ 碱变性法（碱裂解法）； ❖ 煮沸裂解法； ❖ 羟基磷灰石柱层析法； ❖ 质粒DNA释放法； ❖ 酸酚法等。
碱变性（裂解）法基本原理：
在碱性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双 螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双 螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链 不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时， 变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不 能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力 密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合 物等一起沉淀下来而被除去。
2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。
3. 将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10 µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放 置1分钟。
4. 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。
❖ 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： 5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。
步骤一 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。
（活化菌种） 2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基5度是否正确。
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
质粒DNA提取常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
原
1. 不要使用过多菌体。重新纯化
因
DNA，去除蛋白、多糖、多酚
等杂质
1. 混有蛋白
2. 混有RNA
对 2. 加入RNaseA室温放置一段时间
5.加入150μL溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000rpm， 4 ℃离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 ℃下离心2分钟，倒去 上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 ℃离心5分钟。
碱变性法小量提取质粒， DNA的限制性酶切
厦门大学医学院 分子生物学实验教学组
实验目的
❖ 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 ❖ 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基
因和实验目的选择合适载体与限制性内切 酶，设计构建体外重组分子。
质粒(plasmid)
❖ 是• 染是色染体色外体能外够能进够行进自行主自复主制复的制遗的传遗单传位单，位， 包括包真括核真生核物生的物细的胞细器胞（器主（要主指要线指粒线体粒和体和 叶绿叶体绿）体和）细和菌细细菌胞细中胞染中色染体色以体外以的外D的NDANA 分子分，子在，基在因基工因程工中程质中粒质常粒被常用被做用基做因基的因的 载体载。体。
3. 混有基因组DNA
策
3. 加入溶液II 和III后防止剧烈振荡 ，可能把基因组DNA剪切成碎