几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
细胞固定——精选推荐
用多聚甲醛固定悬浮细胞所有的固定方案必须做到：①防止抗原丢失；②透化细胞以便使抗体进入；③尽量使抗原保持能与抗体结合的状态；④维持细胞正常结构。
常用的固定剂种类很多，固定剂的正确选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。
固定剂可分为两大类：有机溶剂和交联剂。
有机溶剂如乙醇和丙酮能够去除脂类物质使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。
交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。
两种方法均使蛋白质抗原部分变性。
因此，在细胞染色中，能够识别变性蛋白的抗体更加有用。
在某些情况下，只有用此类抗体才能得到满意的结果。
往往凭经验选择固定剂。
虽然许多人发现用交联剂固定细胞可以获得较好的结果，但没有通用规则可以参考。
可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
悬浮细胞染色通常用于检测细胞表面抗原。
因为细胞呈悬浮状态，洗涤过程复杂，因此，应注意离心时间不要过长或转速太高。
1．所需溶液4％多聚甲醛(临用前配制)、PBS。
2．操作步骤(1)PBS配制4％多聚甲醛；(2)用PBS洗涤细胞2次，用200g离心5min；重悬细胞。
(3)小心用4％多聚甲醛溶液悬浮细胞，细胞浓度约为1X106／m1 15min，间或摇动；(4)200g离心5rain，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次；室温下静置(5)用含0．2％TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化细胞2min(室温)，有的抗原需15min，具体时间视抗原而定；(6)200g离心5rain，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次。
此时的细胞标本可用于后续的抗体检测。
4%的多聚甲醛溶液的配置方法：100ml双蒸水中加入8g多聚甲醛，然后在水浴锅中加热至50-60℃，加入几滴1mol/L的NaOH，边加边搅拌直至全部溶解，溶解后置于冰水中冷却至室温，加入100ml的2倍的PBS（注意是两倍的PBS），调节PH为7.4左右。
1、为什么在免疫组化中标本要进行固定？（1）防止标本从玻片上脱落；（2）除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；（3）固定的标本易于保存。
一些固定液及方法介绍
一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4•2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin's液及改良Bouin's液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
病理制片中固定液的选择-2019年精选文档
病理制片中固定液的选择由于病理学诊断是诊断的金标准，是辅助临床诊断的主要把关口，也是最后的宣判性诊断。
做好病理诊断，层层步骤就显得尤为重要，包括组织的取材，固定，脱水，浸蜡，包埋及染色。
组织的固定是一个关键的过程，因为没有好的固定就没有好的制片，没有好的制片就不会有好的成品，一张好的切片与固定有着密切的关系。
1固定的目的固定的概念是将采取的活体组织置于化学性溶媒（固定液）中，使其不发生自溶与腐败，保持被采取时的形态。
固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态，迅速防止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，而产生不同的折射率，成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。
因此，固定的组织愈新鲜愈好，固定组织时，应使用足量的固定液。
其固定液的量一般小于组织块总体积的4 倍以上。
2固定液的选择固定液必需要有较强的渗透能力，能迅速地渗入组织内部，不会使组织过度收缩或膨胀，并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶性物质，能使组织达到一定的硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。
组织细胞中不至于因固定引起人为的改变，因为在凝固原生质以后，增加了细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形，并尽可能地避免使组织膨胀或收缩，使细胞内的成分（蛋白质）凝固沉淀下来，由正常的半液体状（胶体）变为半固体状（凝胶），增加媒染作用和染色能力，使组织能够得到充分的固定，便于以后的蜡块保存。
固定液的种类很多，分为单纯固定液和混合固定液，其中混合固定液比较常用。
2.1 常用单纯固定液2.1.1 甲醛（formaldehyde）为非沉淀性固定剂，是一种约有40％重量溶于水的气体，易挥发，市售的为40％的甲醛水溶液，也称为福尔马林液（formalin）。
此液久存自行分解，形成白色沉淀为副醛（三聚甲醛或多聚甲醛）。
实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)
实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。
6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。
另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。
组织细胞固定的原理、基本要求
组织细胞固定的原理、基本要求在病理学中，组织只有经过固定，才能完成随后的一系列制作过程，直至切片的最后完成。
每个医学研究者都能容易地把组织细胞固定起来，但是，要掌握组织固定的原理、过程及其意义是一件十分困难的事，下面我们将逐一阐述。
一、固定的作用组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。
固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。
二、固定的目的1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。
细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。
固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。
另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。
因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。
2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。
细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。
这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。
3、使组织硬化，便于切块。
刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。
组织和细胞的固定方法
组织和细胞的固定方法组织和细胞的固定方法固定的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。
固定还能增加组织块硬度，使其更简单切片，使不同的结构更简单染色。
固定方法有物理固定和化学固定两类，物理固定可采纳空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中快速冷冻）或微波固定等；化学固定有浸润法（immersion method）和灌流法（perfusion method）。
灌流法适用于动物试验中对缺氧敏感的器官，如神经系统和胃肠等取材。
一、浸润法浸润法是组织化学和免疫组织化学常用的固定方法，一次要处理很多组织样品时也多用此法。
预先需估量固定剂的用量，并在取材前配好固定液，分装于小容器内，在容器上标记组别和取材时间。
容器内放人记录组织类型的纸条，以便包埋时辨认。
固定液的用量应是样品的40倍，以保证组织充分固定。
固定时间可依据所选固定液和组织类型而定。
若进行酶组织化学染色，应在4℃短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消逝。
二、灌流固定法此法是经血管途径，将固定液灌注到欲固定的器官内，使生活的细胞在原位准时快速固定，取下组织之后再浸入相同的固定液内连续固定。
灌流固定时大动物多采纳输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血，输入固定液与放血同时进行。
固定液的输人量因个体不同而异，即500―2000ml不等。
小动物多采纳心脏主动脉灌流，如大鼠和小鼠，在吸人深度麻醉状况下，打开胸腔，纵向切快乐包膜，并用纱线在动脉弓下打一松结，然后用静脉输液针从左心室向主动脉方向刺人，针尖刺人后，随即将纱线扎紧固定，勿使其移动，再将右心耳剪开放血。
在灌注固定液前，先用含抗凝剂的37℃生理盐水灌流，冲洗血管内的血液，防止血液凝固堵塞血管。
抗凝剂常用肝素，剂量为40mg/L冲洗液。
肝脏颜色由鲜红变为浅白色时，即可灌流固定液，灌注速度为5～10ml/min，应在30分钟内结束灌注并取材，而后将组织浸入相同的固定液中1～3小时。
实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)
实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗5min。
3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。
5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。
6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。
二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。
另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。
免疫组化固定剂的选择(看到楼下有兄弟 这个问题)(固定剂,免疫组化,固定液,抗原)
免疫组化固定剂的选择（看到楼下有兄弟这个问题）(固定剂,免疫组化,固定液,抗原)相关疾病：脱水固定是免疫组化的第一步，很多人都忽视了这一步，认为用福尔马林就行，其实学问也挺大的用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。
有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
关键词: 固定液固定剂抗原甲醛免疫组化冰醋酸戊二醛固定是免疫组化的第一步，很多人都忽视了这一步，认为用福尔马林就行，其实学问也挺大的用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。
有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。
（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。
但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。
浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g ,蒸馏水90ml）。
有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。
固定液的分类和选择原则
固定液的分类和选择原则以固定液的分类和选择原则为标题，我们来探讨一下固定液的相关知识。
一、固定液的分类固定液是一种用于固定生物组织或细胞的溶液，根据不同的固定目的和化学成分，可以将固定液分为以下几类：1. 醇类固定液：如乙醇、甲醇等。
这类固定液常用于快速固定和保存细胞和组织的形态结构，同时具有很好的保护作用，适用于常规组织学检查。
2. 酸类固定液：如酸性酒精、酸性硫酸铜等。
这类固定液主要用于固定某些特定的细胞或组织结构，例如染色体或胶原纤维等。
酸类固定液对脂质物质的固定效果较差，因此不适用于脂质含量较高的样本。
3. 中性缓冲液：如PBS（磷酸盐缓冲液）、Hank's液等。
这类固定液主要用于固定细胞和组织的生物学活性，能够较好地保持细胞和组织的形态和功能，适用于免疫组化和分子生物学实验。
4. 有机溶剂固定液：如乙酸、乙酸乙酯等。
这类固定液在固定过程中对细胞和组织的脂质物质和溶胀性物质具有较好的固定效果，适用于脂质或溶胀性物质含量较高的样本。
二、固定液的选择原则在选择固定液时，我们需要考虑以下几个原则：1. 根据固定目的选择：不同的实验目的需要选择不同的固定液。
例如，要观察细胞形态结构，可以选择醇类固定液；要进行免疫组化实验，可以选择中性缓冲液。
2. 根据样本性质选择：不同的样本性质对固定液的选择有所差异。
例如，脂质含量较高的样本适合选择有机溶剂固定液；而含有胶原纤维的样本可以选择酸类固定液。
3. 考虑固定液的渗透性：固定液的渗透性对于固定效果至关重要。
一般来说，较强的渗透性可以提高固定效果，但同时也可能对细胞或组织的形态和功能产生一定影响。
因此，需要根据具体实验要求选择合适的固定液。
4. 考虑固定液的毒性和安全性：固定液中可能含有一些有毒物质，因此在选择固定液时，需要考虑其对实验人员和环境的安全性。
同时，在实验过程中也要注意安全操作，避免接触到固定液。
总结：固定液的分类和选择原则是进行组织学和细胞学研究中非常重要的一环。
组织细胞固定的原理、基本要求
组织细胞固定的原理、基本要求在病理学中，组织只有经过固定，才能完成随后的一系列制作过程，直至切片的最后完成。
每个医学研究者都能容易地把组织细胞固定起来，但是，要掌握组织固定的原理、过程及其意义是一件十分困难的事，下面我们将逐一阐述。
一、固定的作用组织经一系列的处理后，就必须进行固定，当然有的组织是先固定，再进行处理，然后再固定。
固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。
二、固定的目的1、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。
细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。
固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。
另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。
因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。
2、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。
细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。
这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。
3、使组织硬化，便于切块。
刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。
细胞固定及常用的固定液
细胞固定及常用的固定液•取材后的组织需立刻投于固定剂中–固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；–对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
•常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。
其固定原理不同，各有优缺点。
–醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）–醇类（常用乙醇）–其它（丙酮）(1) 醛类•甲醛(福尔马林)应用最广–原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
–优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
–缺点：•甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；•醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；•分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
–注意事项：• C)，为此组织块不宜过厚。
缩短固定时间，降低固定温度•改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
•固定后充分水洗以减少分子间交联。
•切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
•戊二醛：–穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
•多聚甲醛(常用4%)：–可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
•主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类•最常用的醇类固定剂是乙醇。
–其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
–优点：穿透性强、抗原性保存好。
–缺点：•脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
•乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂•丙酮：–对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
Ziehl一Neelsen法法固定大体标本步骤
Ziehl一Neelsen法法固定大体标本步骤固定的目的是要保存细胞的形态结构，以利于染色之后清晰地显示细胞的形态。
因此固定液和固定方法便成为重要的因素，选择固定液和固定方法是制做高质量涂片的前提。
1.固定液最常用的固定液为95%的酒精。
酒精作为一种脱水剂能够防止细胞内的酶将蛋白质分解和自溶，凝固细胞内的物质（蛋白质、糖类和脂肪等），使细胞保持清晰的结构，也易于细胞结构的着色。
在Pap和HE染色方法制片时，特别注重这种固定液及其方法。
这种固定液也能保存抗原，因而利于免疫细胞化学染色。
有些实验室在95%酒精中滴加冰醋酸以溶解红细胞。
95%酒精是可以满足细胞学标本的基本要求的。
在针吸标本做电镜检查时，应采用4%戊二醛固定24小时以上，在制做电镜切片前还需用1%XXX固定液固定一小时。
2、固定方法标本在经涂片后固定的方法至关紧要。
一般认为采用湿式固定（湿固定）的效果最佳，涂片后趁标本新鲜而湿润时，立即投入盛有固定液的固定缸内。
必须注意的是不可久置致使干燥后进入固定液，也不能在固定后干燥，因为干燥涂片均会影响染色的效果。
标本若为粘稠物应立即固定；若为液体标本，在树起载玻片不流动的情况投入固定液，为防止收缩流动采用喷雾法固定或滴加法固定。
总之，在潮湿状态下固定的涂片染色效果最佳。
对于淋巴结的针吸涂片在固定时，固定液95%酒精的浓度应该在90%至93%的浓度之间，因为淋巴细胞的胞质量少，易为固定液所穿透，造成细胞或核的收缩变形，致使观察困难，尤其是细胞核辩认更是无法观察。
95%酒精固定液就应该及时更换，一般每周更换一次或每固定100张淡片后应更换固定液一次，以保持酒精的浓度在最佳状态。
固定的时间一般常规制片应在2-3小时左右为宜，快速涂片在轻薄和均匀的情况下5分钟左右即可，但要注意多做几张涂片备用并留一张作常规染色。
常用细胞固定染色原理与方法
常用细胞固定染色原理与方法一、固定与固定液(一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。
1.目的(1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。
(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。
(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。
(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。
2.时期(1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。
(2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。
此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。
小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。
如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。
一般上午8-10点为取材最佳时间。
玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。
在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。
用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。
蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。
蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。
3.固定时的注意事项(1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。
(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。
(3)固定的时间要合适：与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。
经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。
常用的组织固定液及配制
常用固定液及其配制固定液分单纯固定液和混合固定液。
1甲醛（formal dehyd e）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formal in）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
yzbaiwrote:（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。
对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。
能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。
经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。
免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点概要
从大概标本上切除适当的组织资料进行研究就是取材。
取材不单在免疫组化而且在惯例病理检查中也十分重要。
用于免疫组化的组织一般取材大小为。
取材时应剔除脂肪和钙化,不然会影响切片 ,出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包含动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等 ,有关各样标本的取材方法分述以下。
一、动物的致死法及取材(一致死法(1 空气栓塞法向动物静脉内注入必定量的空气,使动物很快死亡。
一般合用大动物 ,比如兔、犬、猫等动物。
(2 麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷的棉球连同动物一同放人密闭容器内进行麻醉 ,也可用 4%戊巴比妥作静脉注射 ,或用 20%氨基甲酸乙酯做腹腔注射。
合用于鼠等小动物。
(3 断头法用剪刀剪去动物的头部,待血液流出后立刻取材。
合用于小动物。
(4 去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5 股动脉放血法动物麻醉后,切开股动脉放血致死。
(二取材注意事项(1 最幸亏动物心脏还在跳动时立刻取材,并快速投入环保组织固定液内。
脏器的上皮组织易变质 ,争取在死后半小时内取材完成,不然免疫组化染色时会产生背景染色。
(2 切取组织使用的刀、剪要求尖利 ,防止往返挫动组织。
因动物组织质脆 ,所以夹取组织时切勿使劲过重 ,免得挤压伤害组织。
二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应依据实质需要进行,一般取材部位和数目以下。
(1 心和大血管右心室一块 ,左心室一块 ,主动脉一块 ,取材部位可在距主动脉瓣5cm 处。
(2 肺右下叶一块 ,切成正方形 ;左下叶一块 ,可切成长方形。
(3 肝右叶一块 ,切成正方形 ;左叶一块 ,切成长方形。
(3 脾一块。
(4 胰一块。
(6 肾两肾各一块 ,包含皮质、髓质和肾盂。
右肾一块切成正方形,左肾一块切成长(7 膀胱一块。
(8 肾上腺左、右各取一块。
(9 消化道食管一块 ,胃窦部一块 ,小肠一块 ,淋奉承一块 ,直肠一块。
(10 骨脊椎骨一块。
(11 胸腺一块。
(12 子宫宫颈和宫体数块。
组织固定液与固定方法选择的探讨
“固定”是指将组织浸入适当的化学试剂中，使组织细胞内的物质尽量接近其取材时的形态结构和位置的过程［1］。
固定能使组织中的各种物质沉淀和凝固起来，终止或抑制外源性和内源性酶的活性，防止细胞自溶，保持细胞形态［2］。
固定是制作大体标本和显微镜切片标本的关键，良好的固定有利于切片标本的制作和染色，使组织产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便观察、鉴别和硬化组织［3-4］。
固定液可以抑制组织自溶，保持离体组织细胞与生活时的形态相似，使细胞内一些蛋白质等沉淀或凝固，有利于固定后物质的确切定位，是保存组织器官用于病理诊断的必需过程［5-6］。
不同固定液对组织细胞的穿透力不同，可导致细胞内黏多糖、蛋白质、核酸、脂类和低分子质量物质等不同程度的丢失，由固定液因素导致组织细胞形态的改变，对病理诊断产生很大影响，比其他技术操作因素引起的组织细胞形态改变更难把握。
而选取良好的固定液可使组织固定均匀、收缩小、结构清晰，利于保存组织细胞的抗原性，为免疫组化、电镜观察等奠定坚实的基础［7-8］。
本研究就组织固定液和固定方法的选择作如下探讨。
1固定液1.1固定液成分甲醇：为沉淀类固定剂，对组织渗透性强，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白［9］。
可以固定核染色质及其部分内容物、核膜、细胞质及胶质等［10］，且固定后核浆对比鲜明，组织结构清晰，能基本保持细胞的正常形态［11］。
乙醇：是一种可溶解脂肪和类脂的脂溶剂，穿透力缓慢，长时间浸泡可使组织硬化，细胞核变形，细胞质收缩，蛋白质变性，糖原沉淀［12］。
乙醇对组织细胞既有固定作用又有脱水作用，一般固定组织以80%～95%浓度为好［13］。
丙酮：是一种易燃易挥发的无色液体，对组织渗透力强，能使蛋白质沉淀，但不能很好地保存糖原，且在部分组织中对核的固定效果欠佳［14-16］。
戊二醛：是一种具有双重作用的醛类。
对糖原、糖蛋白、微管内质网和细胞基质等有较好的固定作用可使组织保存良好，适合电镜和酶组织标本的固定，但其穿透力较弱［12，17］。
悬浮细胞固定方法
悬浮细胞固定方法
悬浮细胞固定方法：
① 准备固定液，选择适合细胞类型的固定液，如甲醛或乙醇溶液；
② 收集细胞，通过离心收集悬浮细胞，去除培养基；
③ 洗涤细胞，用PBS或生理盐水轻轻洗涤细胞，去除残留培养基；
④ 重悬细胞，将洗涤后的细胞重悬于少量PBS中，形成较高浓度的细胞悬液；
⑤ 添加固定液，缓慢加入预冷的固定液至细胞悬液中，轻轻混匀；
⑥ 固定时间，根据细胞类型和实验需求，设定适当的固定时间，通常为10-30分钟；
⑦ 再次离心，固定完成后，再次离心去除固定液；
⑧ 洗涤固定细胞，用PBS洗涤固定后的细胞，去除多余的固定剂；
⑨ 二次固定，如果需要，可进行二次固定以增强固定效果；
⑩ 再次洗涤，重复洗涤步骤，确保固定剂完全去除；
⑪ 调整浓度，将固定后的细胞重悬于适量PBS中，调整至实验所需的细胞浓度；
⑫ 存储备用，将调整好的细胞悬液分装保存，根据需要冷藏或冷冻备用。
几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
；’. 几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
（3）Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
（5）Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
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几种细胞固定方法
选择最佳固定液标准是：
（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；
（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；
（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；
（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
（1）4%中性甲醛固定液：
最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
（2）乙醇固定液：
使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：
主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：
适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：
多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
（3）Bouin固定液：
非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
（4）Carnoy固定液：
穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
（5） Zenker固定液：
经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。