液相及液质分析方法学的开发及验证
液质联用分析实验报告
液质联用分析实验报告一、实验目的本实验旨在通过液质联用分析方法，研究食品中的有害物质及其含量，为食品安全问题提供科学依据。
二、实验原理液质联用分析是将液相色谱（LC）和质谱（MS）的优点结合在一起，通过色谱分离和质谱分析技术，对样品中的化合物进行快速准确的识别和定量。
LC与MS的耦合使得LC在分离过程中能够直接将分离的化合物送入MS进行分析，并能够快速准确地进行质量分析。
三、实验步骤1.样品处理：将食品样品进行研磨和溶解，制备成适合LC-MS分析的样品溶液。
2.色谱条件设置：设置LC柱、流动相、流速、梯度洗脱等参数。
3.MS条件设置：设置电离模式、扫描范围、碎裂能量等参数。
4.样品注射和分析：将样品溶液注入LC-MS系统进行分析。
5.数据处理：根据分析结果，计算样品中有害物质的含量，并生成相应的图表和报告。
四、实验结果与讨论通过分析的样品，我们检测到其中一种有害物质A的含量为10mg/kg，超过了食品安全标准的限制。
进一步分析发现，在样品中还存在其他有害物质B和C，但其含量均在安全范围内。
通过液质联用分析技术，我们能够快速准确地对食品样品中的有害物质进行分析和定量。
这为我们提供了一种重要的工具，用于食品安全问题的研究和监测。
五、实验总结本实验通过液质联用分析方法，对食品样品中的有害物质进行了检测和定量分析。
实验结果显示，样品中存在一种有害物质的含量超过了安全标准，提示食品的安全性存在问题。
通过本实验的实施，我们深入了解了液质联用分析的原理和方法，并掌握了其在食品安全研究中的应用。
实验结果对于我们加强食品安全管理具有重要意义，为进一步解决食品安全问题提供了科学依据。
HPLC分析方法的开发与验证
HPLC分析方法的开发与验证分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。
一、分析方法开发（Development）分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。
目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。
1. 色谱柱的选择（Column）原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。
我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。
一般选用直径为4.6mm或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。
对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。
三种类型包括：▪1) 普通的C18或C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的Zorbax Eclipse C18等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；▪2) 封端处理或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的SymmetryShield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，AgilentZorbax Bonus-RP，DIKMA SpursilC18等，其它公司如“菲罗门”（Luna）和“热电”（Hypersil 、Syncronis）也有相应的色谱柱；▪3) 填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基、氨基、氰基等色谱柱等，很多公司都有。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
《液相色谱方法开发》课件
检测器的选择：选择合适的 检测器，如紫外、荧光等
样品的处理：对样品进行适 当的处理，如稀释、过滤等
检测灵敏度的优化
提高检测灵敏度的方法：增加样 品浓度、延长检测时间、提高检 测温度等
检测灵敏度的评估：使用标准样 品进行检测，计算检测限、定量 限等指标
添加标题
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优化检测条件的选择：选择合适 的流动相、色谱柱、检测器等
重复性验证的目的：确保方法的稳定性和可靠性 重复性验证的方法：多次重复实验，比较实验结果 重复性验证的标准：实验结果的差异应在可接受范围内 重复性验证的注意事项：确保实验条件一致，避免实验误差
方法的线性范围验证
线性范围：指样品浓度与检测 信号之间的线性关系
验证目的：确保方法在特定浓 度范围内具有线性关系
液相色谱法的应用
分析化学： 用于分析 有机化合 物、无机 化合物、 生物大分 子等
药物分析： 用于药物 成分分析、 药物代谢 研究等
环境监测： 用于水质、 大气、土 壤等环境 样品的分 析
食品分析： 用于食品 添加剂、 农药残留、 微生物等 分析
生物技术： 用于蛋白 质、核酸、 多肽等生 物大分子 的分析
如二硫苏糖醇、尿素等
氢氧化钠等
核酸样品：使用核酸酶和变性剂处理， 如RNase A、SDS等
药物样品：使用酸和碱处理，如乙酸、 氢氧化钠等
脂质样品：使用有机溶剂和表面活性剂 处理，如乙腈、Triton X -100等
环境样品：使用固相萃取和液液萃取 处理，如C18、乙酸乙酯等
实际应用案例解析
案例一：药 物分析
案例三：食 品检测
案例二：环 境监测
案例四：生 物样品分析
液相及液质分析方法学的开发及验证
液相及液质分析方法学的开发及验证液相及液质分析方法学的开发及验证是化学分析领域中非常重要的研究内容。
液相分析方法学主要研究如何选择适当的试剂、溶剂、分析柱等条件，使样品溶解、分离、测定和定量变得更加准确、灵敏和可靠。
液质分析方法学则是在液相分析方法学的基础上，通过耦联质谱等仪器进行检测和分析，可以获得更高灵敏度和更好的特异性。
液相及液质分析方法学的开发和验证通常需要以下的步骤和方法。
首先，基于需求和目标，确定研究对象和分析目标。
确定所需分析的化合物或成分，并有清晰的分析目标，比如检测限、灵敏度、准确度等，以指导后续研究。
其次，选择合适的试剂和溶剂。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的试剂和溶剂，以提高分析的准确性和灵敏度。
试剂应具有高纯度和稳定性，以确保试剂本身不会引入干扰物质。
溶剂的选择要考虑溶解能力、流动性以及对仪器的兼容性。
然后，进行样品制备和前处理。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的样品前处理方法，如液液萃取、固相萃取等，以提高分析样品的纯度和准确性。
样品前处理的步骤要具有高效性、选择性和稳定性，以确保获得准确的分析结果。
接下来，选择合适的分析仪器和方法。
根据分析目标和样品性质，选择适合的分析仪器和方法，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱等。
根据仪器的参数和分析方法的要求，进行合理的调整和优化，以获得最佳的分析条件。
在开发出一套满足分析要求的方法后，需要进行验证。
验证的目的是评估方法的可靠性和适用性。
验证通常包括准确度、精密度、选择性、线性范围、检测限等方面的评估。
通过在不同条件下进行重复性试验，并进行统计分析，评估方法的精准性和可重复性。
同时，通过对样品添加不同浓度的目标物质或干扰物质进行检测，评估方法的选择性和准确度。
此外，还需要进行方法的稳定性和恢复率等评估。
最后，将开发和验证的方法应用于实际样品的分析。
根据实际的需求和样品的性质，进行实际样品的分析。
在实际分析中，要注意方法的适应性和准确性，并进行合理的质量控制措施，以确保获得可靠、准确的分析结果。
液相色谱的方法开发液相色谱的方法开发液相色谱的方法...
离子交换树脂的交换容量
液相色谱柱及分离机理的关系
❀ 从色谱方法上分
✎ 正相 / 反相 ✎ 离子交换 ✎ 分子体积排除 ✎ 亲合 ✎ 疏水回受
❀ 从柱子类型上分
✎ 分配 / 吸附 ✎ 离子交换 ✎ 凝胶 ✎ 亲合
色谱柱化学及外形结构的关系
液相色谱柱
填料
柱管
颗粒表面性质
颗粒度
长度
内径
材料
化学性质 k α 分辨率
对HPLC柱的了解 二
❀ 平均孔径/孔体积 ❀ 孔径/孔体积分布
✎ 大的孔径可分析高分 子量的分子
对HPLC柱的了解 三
❀ 键合相化学
✎ 影响化合物的分离度 α ✎ 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 ✎ 可能导致色谱的分离机理不同 ✎ 如 C18 C8 CN
对HPLC柱的了解 四
❀ 含碳量
机械因素 N
寿命 柱效 速度 溶剂消耗
对HPLC柱的了解
❀ 平均颗粒度 颗粒度分布
✎ 颗粒度(dp)
➠ 颗粒度越小 柱效越高(传质好 涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差)
✎ 颗粒分布
➠ 颗粒分布越宽 柱效低(渗透性差)
✎ 颗粒形状
➠ 球型 柱效高 重现性好 柱床结构均匀 ➠ 无定型 柱床结构不均匀
流动相线性速度不均匀 谱带扩展
Symmetry C8
12
Resolve C-18
12
Ultrasphere ODS 11
Partisil ODS-3
11
µBondpak C-18 10
Nova-Pak C-18
7
k‘苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
高效液相分析方法开发1
分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。
一、分析方法开发分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、检测波长的选择和梯度的优化几个方面。
目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。
1.色谱柱的选择原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um 填料的色谱柱长要250mm，3.5um填料的柱长要150mm，基本上都是各个粒径柱长最长的。
我比较喜欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。
一般选用直径为4.6mm 或3.0mm的柱子，太细了可能会增大柱外效应。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A左右，能满足分析检测的需要。
对于API分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。
三种类型包括：1)普通的C18或相应的C8色谱柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱;2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerra RP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱;3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。
一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异，这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换一个厂家的柱子也是一个很好的选择。
液相色谱的方法开发
分离机理及色谱柱
选HPLC参数时的基本考虑
溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异 摸索条件的重要线索
不同色谱柱的含碳量
色谱柱 C% k‘苊 (50/50的乙腈/水) Symmetry C18 19 17 Zorbax ODS 17 15.7 LiChrosorb RP-18 15 10.3 Symmetry C8 12 12.5 Resolve C-18 12 12.4 Ultrasphere ODS 11 11.3 Partisil ODS-3 11 12.0 mBondpak C-18 10 7.9 Nova-Pak C-18 7 5.5
极性问题
液相色谱的分离机理
正相 反相 体积排除 离子交换 其他 不同的分离模式是不同的机理
吸附色谱的分离机理
随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短
吸附色谱概述
分离基于样品的极性差异。 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的流动相∶ 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相∶ 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。
Waters不同品牌的色谱柱
Resolve 平均孔径90A，5/10m低活性硅胶 非常高的疏水性，无端基封口 有利于低保留的中性及酸性化合物分离 Delta-Pak 有100A和300A两种孔径，5/15m硅胶 中到高的疏水性，端基封口 适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱
新一代硅胶基质的色谱柱
Symmetry 高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均<10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点 好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长
液相、液质检测技术原理及应用
常用的定量方法
峰面积百分比法
由于检测技术的影响，在液相色谱 中不常用
外标法
在液相色谱中用的最多
内标法
准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多
峰面积百分比法定量
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
各组分要全部流出、全部被检测，并对检 测器的响应值一样简单，液相色谱目前很 难做到这点
谱。
A. 飞行时间质谱
离 子
+
源
+
+
+
▪ 所有离子一同起跑 ▪ 质量小的跑得快 ▪ 时间分辨
B. 四极杆质量分析器
被分析离子由DC和RF电压控制
Resonant Ion Nonresonant Ion
Detector
Source
dc and Rf voltages
C. 离子阱
原理与四极杆类 似
只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器。
质谱真空系统2
质谱仪之所以在高压下工作是为了 ...
尽量减少离子-分子之间的碰撞 (即,得到最大平均自由程)
碰撞可能导致离子偏离所期望的轨迹(由离子源到四极杆检 测器)
碰撞可能导致产生意外的离子或带来副反应
防止在高电压 (用于某些离子聚焦)下生成电弧
❖ 注意某些可以引起荧光猝灭的物质对检测的干扰，如 流动相中溶解的氧、卤素离子、重金属离子、硝基化 合物等
荧光检测器
hn1
激发波长
*
+ hn1
*
hn2+
A*
Emission Wavelength
hn2 荧光
A
A
衍生化试剂
液相色谱分析方法开发的技巧
液相色谱分析方法开发的技巧你是否一直头疼于液相实验室或是方法开发问题出现的各种意外状况？或许本文总结的“应该避免做的七件事【DDT（Don't Do That）】”可以帮到你。
以下提到7个DDT并没有特别的先后顺序，但是如果都能避免的话，我相信可以让在实验室的日子少一些鸡飞狗跳，多一些岁月静好。
DDT #1：不要滴定含有有机溶剂的溶液配制缓冲液和并调节其pH有三种方法：正确的方法，简便的方法和错误的方法。
例如我们打算配1000 mL pH 4.0，浓度为20 mM的醋酸盐缓冲液。
正确的方法根据一些网站或者计算工具的计算结果称量好需要的醋酸和醋酸钠的量，然后使用容量瓶稀释到1000 mL。
或者也可以分别配好20mM的醋酸溶液和醋酸钠溶液，然后混合在一起直到测到的pH是4.0为止。
这两种方法都可以得到大约1000 mL pH 4.0 浓度20 mM的缓冲液。
简便的方法是先配好1000 mL 20mM的醋酸钠溶液，然后使用浓醋酸滴定到pH达到4.0。
这方法会配得比1000 mL稍微多的缓冲液，而且使用了高浓度的醋酸滴定，所以缓冲液浓度不再是20mM。
但是这有关系吗？如果使用反相柱的话，缓冲液的浓度影响并不大，所以得到的谱图基本不会有差别。
但是如果使用离子交换、HILIC、混合模式或是其他的离子作用模式，缓冲液的浓度就有影响了，这时使用上述两种不同方法配出来的缓冲液很可能得到不同的谱图。
所以在这些情况下不管使用哪一种方法配制的缓冲液，都要把配制具体方法记录下来，确保以后的分析人员在重复实验时可以得到相同的分析结果。
错误的方法是将缓冲液与有机溶剂（如甲醇或者乙腈）混合后再进行pH滴定。
要知道当把有机溶剂加入到水溶液中后，pH计会测出与加入有机溶剂前不同的数据，而且实验室的温度对滴定含有有机溶剂的缓冲液影响也大，我就有遇到使用这种方法配出的缓冲液，在夏天开发出来的方法，在冬天就没法重复，就是因为实验室温控不好而导致冬夏温差大，结果冬天和夏天利用这方法配制的缓冲液就有明显的差异。
高效液相分析方法验证
Isocratic vs. Gradient 等度 VS. 梯度
Method Development 方法开发 – Initial Chromatographic Conditions Initial 色谱条件
C18 Column: first choice C18柱：首选
Short length: 10 cm or 15 cm 短柱： 10 cm or 15 cm
Small diameter: 3.5 µ m or 5 µ m 小的粒径： 3.5 µ m or 5 µ m
End-capped
封尾
Method Development 方法开发
Pore size, Surface area, End capping 孔径，表面积，封尾
Method Development 方法开发 – HPLC Column色谱柱：考考你 ???
Particle Size 粒径Length长度 Expected N 要求
3.5 µm
5 cm
4200
3.5 µm
Method Development – HPLC Mobile Phase: Buffer 流动相：缓冲液
Buffer Selection Principle:
缓冲液选择原则
The pH of the mobile phase buffer should NOT be within ±2 pH units of the pKa values of the
Ion-Exchange: Dionex column 离子交换： Dionex column
液相色谱方法开发与方法验证
岛津液相色谱方法开发与应用培训---方法开发和方法验证梁炳焕岛津国际贸易（上海）有限公司广州分析中心系统方法开发•开发方法之前应明确以下各项–分离目的–样品性质和需要的预处理–检测方法•开发分离方法的步骤–选择合适的HPLC方法始建立方法–开始建立方法–改善分离–检查问题–完善方法•是分析还是回收样品组分？•是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？•是否需要解析出样品的所有成分(例如, 对映异构体,非对映异构体,同系物,低聚物,痕杂物) , , , , 痕量杂物…)?•如需定量分析，需要多高的精密度？(如原料,制剂, 环保样•本法需用于几种样品剂型,品等) ？•未来使用该方法分析的样品数的多少？•未来使用该方法的实验室拥有的HPLC设备和技术能力？有关样品组分和性质的重要信息•现有组分的数目•组分的结构以及具有的官能团•组分的分子量•组分的pKa值•样品基质的性质：溶剂, 填充物等•要检测组分在样品中的浓度范围•样品溶解度预样品的性质以及是否要进行预处理•来自不同形态的样品:可以直接进样的溶液––需要稀释，缓冲，或者加入第二种溶剂的溶液–能溶解在流动相中的固体物–配制样品前应称重–含有能引起柱效损失的物质的样品-要求萃取或过滤–被分析物中含有不溶物-要求萃取或过滤检测方式•根据不同的分离目的需要不同的检测器.–测量单个或少量的化合物时, 理想的检测器应该仅仅对–目标物有响应而对其他物质没有响应高选择性和高灵敏度对于定性分析和制备色谱,理想的检测器是通用型的检–,测器, 这样混合物中的每一种物质都能被检测出来. –并不需要特别高的灵敏度检测器检测器化合物类型UV/PDA最常用的检测器不适用于烷烃和糖类RID / ELSD通用型检测器荧光检测器适用于能产生荧光的物质具有高选择性和灵敏度电化学检测器适用于易氧化和降解的化合物具有高灵敏度和选择性电导检测器用于可电离的化合物如有机酸适用于可电离的化合物，如有机酸和无机酸柱前或柱后衍生化液相色谱检测器的比较UV VIS RF MS检测器UV-VIS （紫外）(荧光）RID （示差折光）ELSD （蒸发光散射）PDA （二极管阵列）（质谱）化合物需具备的特征性紫外-可见光吸收化合物荧光吸收化合物所有有机化合物所有有机化合物紫外-可见光吸收化合物所有有机化合物主要应用范围定量定量定量定量定性和定量定性和定量定量分析的灵~100b~01b ~1000b ~100b ~100b ~01b 敏度100 ppb 0.1 ppb 1000 ppb 100 ppb 100 ppb 0.1 ppb (SIM)定量分析的选择性midhigh low low Mid High 定性分析的灵敏度---->1000 ppb10 ~ 100 ppb (Scan)择种模式选择一种HPLC•对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的.•离子对反相模式和正相模式是第二选择.•具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条具有以下任何性质的样品经常要求些特殊的条件.大分子量的样品–, 如聚合物, 碳水化合物或蛋白质–含有光学异构体的混合物(对映体)–含有其他异构体的混合物–含有无机盐的样品影响分离的反相条件HPLC不同分离条件优先选择柱尺寸（长度，内径.）15或25 cm×2-6 mm,粒径3-5 μm固定相C8or C18C流动相溶剂A/B 水/乙腈（甲醇）%-B 不定的%B缓冲液（化合物，pH，浓度）磷酸盐/醋酸盐, pH 2-7.5，10-100 mM 添加剂（eg., 离子对试剂, 氨）阳离子中加1-20 mM 高氯酸钠120M阴离子中加1-20mM 四丁基铵盐流速0.1-2 mL/min温度室温到60℃样品体积≤100 μL质量≤100 mg主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱何时应用此方法反相模式流动相：水/有机溶剂对于能溶解于水/有机体系中的中性或非离子化合物，首选该模式色谱柱：C 18(ODS)，C 8，苯基，三甲基氯硅烷（TMS ），氰基反相离子对模式流动相：水/有机溶剂,加一种缓冲液控制PH 值离子或可电离的化合物, 特别是碱性或阳离子化合物离子对试剂色谱柱：C 18(ODS)，C 8，氰基正相模式流动相：有机溶剂混合液色谱柱硅胶醇基当反相模式或反相离子对模式无效时的较好选择:首选为不溶解于水/有机混合液的亲脂样品异构体混合物和制备色谱柱：硅胶, 氨基, 氰基, 二醇基的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC ( 硅胶最好)HPLC 方法的特性次要方法的特性方法/特点/色谱柱何时应用此方法离子交换模式流动相：水相，另以缓冲液控制pH 分离无机离子混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及值色谱柱：阳离子或阴离子交换柱有关的化合物的良好的选择.尺寸排阻色谱流动相：水相(凝胶过滤)有机相(凝胶渗透)分离高分子量样品，如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G 色谱柱: 二醇基（凝胶过滤用）聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗透用）分子量的分布改善分离•两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs>1.5个邻峰到线分离其分离度•对简单混合物，应使分离度Rs>2•10, Rs>1对含个或更多成分的样品,分离度的要求可降到峰面积重叠率开发方分离HPLC方法的分离目的目的内容分离度定量分析的一般要求Rs > 1.5分离时间小于5-10 min时，日常工作较理想定量含量测定：RSD ＜1%；要求不高或痕析, RSD ＜5%RSD压力最好＜15 MPa，20MPa＜20 MPa通常情况（假设是新柱）峰形峰越窄越好，越对称越好溶剂消耗流动相的消耗量越小越好检查问题在方法开发期间应重视方法引起的问•在方法开发期间，应重视方法引起的问题–柱效下降•谱带增宽–样品的溶剂不适合–高压引起的柱效下降H –流动相或其pH 值不适合•高压–样品前处理不当–流动相不适合完善方法•方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于方法本身在日常工作中应经受住考验应适用于所有的有关实验室•HPLC 方法必须严格适合下列标准–精密度–准确度–稳定性–可转移性•方法有效性检查对方法开发来说是非常重要的开发HPLC方法的步骤1.有关样品的信息, 明确分离目的,2. 是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等.3. 选择检测器和检测器设备选择检测和检测设备选择方法进行预实验;评估分离条件4. LC方法，进行预实验;5. 最佳分离条件方开发HPLC方法的开发使用反相模式对分离进行优化分离效果的改善相邻两峰完全分离其分离度Rs>1.5.峰面积重叠率容量因子的函数容量因子,k’,t -t k’ =t 010t 1t 0t 1 =溶剂峰的保留时间t 0= 溶剂峰的柱死时间(非保留时间)理论塔板数,N塔板数,方程:N = 16 x ( Rt / W )2Rt 实际修饰方程:N 554(Rt /W AreaN = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2综合修饰方程H:N = 6.28 x (Rt x H / Area)2W 1/2H 1/2W选择性因子αα =k’1k’2t -t 0t 2-t 0=1 10 t 1t 2分离因子是两个峰分离度的个体现t 0分离因子是两个峰分离度的一个体现怎样提高N -第一步-•HETP = 柱长/ N范德米特方程E T P最佳流速每个柱子都有H 最佳流速线速率增加柱子数目虽然增加柱子数量能提2.0高N, 但是分离度仅仅能增加40％. .1.0同时柱压柱压会剧烈增加1 2 3 4 5 6 7 8柱子数量增加柱子数量并不实用！怎样提高N -第二步-3 m降低填料粒径并且μ5 μm 选择每根柱子的最佳流速.N10 μm如果改变了粒径, 必须使用相同的填充Flow rate物. 否则会改变选择性4.0 mmID 0.6 mL/min 4.6 mmID 0.8 mL/min 6.0 mmID 1.0 mL/min怎样改善k’降低有机溶剂的比例.尽量使k’= 1 –10，6 8 12最好使k’= 2 –10，k’分离度不够2 4 Rs1-202-10值小于2，分离度不够k’值大于10，会扩展运行时间0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200 k’峰加宽(1) 灵敏度变小(2)k(2)定量准确性变差甲醇/乙腈/ THF溶剂的选择1) 与水易于混和2)常规的波长下没有紫外吸收2) 常规的波长下，没有紫外吸收3) 低粘度4) 极性有差异)与甲醇相比，乙腈有以下优点1)1) 操作压力更低2) 洗脱能力稍高3) 在低波长范围内可以应用215般建(检测波长低于215nm 时一般建议使用乙腈)选择乙腈更好，然而, 由于价格因素和ACN 的毒性，甲醇仍然是首选。
液相色谱仪HPLC分析方法验证 液相色谱解决方案
液相色谱仪HPLC分析方法验证液相色谱解决方案为了保证分析检测结果精准、牢靠，必需对所接受的分析方法的精准性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。
从本质上讲，方法验证就是依据检测项目的要求，预先设置确定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所接受的分析方法符合检测项目的要求。
方法验证在质量掌控上有紧要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是订立质量标准的基础。
方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、精准度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。
1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。
对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。
必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。
一般要求产品和杂质之间的分别度大于2.0、2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原材料或产品的浓度呈线性关系的程度。
线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。
一般用储备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用zui小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。
3.范围范围指在能够达到确定的精准度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。
简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。
需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80%～120%。
4.精准度精准度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证精准度。
精准度应在规定的范围内建立，对于原材料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原材料药进行测定，必要时可与另一个已建立精准度的方法比较结果。
液相、液质检测技术原理及应用
液相色谱检测器
7、 对样品无破坏性 8、 响应快，能快速、精确地将流出物检测 9、 能给出定性的信息 10、稳定、可靠，重现性好，使用方便 11、价格便宜
紫外检测器
应用最广的检测器，属于浓度敏感型检测器 优点：
1、灵敏度高，噪声低，线性范围宽 2、对流动相基本无响应，受操作条件和外界
环境变化影响小，流速和温度变化不敏感， 可用于梯度洗脱。 3、对样品无破坏性，可以用于制备色谱或与 其他检测器串连。 4、结构简单，使用方便 缺点： 1、仅适用于测定有紫外吸收的物质
❖ 注意某些可以引起荧光猝灭的物质对检测的干扰，如 流动相中溶解的氧、卤素离子、重金属离子、硝基化 合物等
荧光检测器
hn1
激发波长
*
+ hn1
*
hn2+
A*
Emission Wavelength
hn2 荧光
A
A
衍生化试剂
OPA 伯胺衍生化试剂CHO+ R-NH2
CHO
A
o-phthalaldhyde (OPA)
液相色谱柱
类别 制备柱
尺寸（柱径/mm ）
>10
备注 生产型制备柱直径可
达几十厘米
半制备柱
5~10
----
分析柱
2～5
典型柱为4.6或4
微
细径柱
型 柱
（narrow bore column）
毛细管柱（capillary
column）
0.8~2.0 0.05~0.5
一般柱管可为金属亦 可为塑料制，如PEEK
二极管阵列检测器
二十一世纪标准检测器 色谱定性依据：
保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器
多组分药物配方中高效液相分析方法的开发与验证
多组分药物配方中高效液相分析方法的开发与验证摘要：本文针对多组分药物配方的高效液相分析方法进行了开发与验证。
首先，通过选择合适的样品和制备方法进行样品制备。
然后，根据药物特性和分析目的选择合适的色谱柱和流动相，并通过优化流动相组成和流速实现高效分离。
接下来，根据药物特性选择合适的检测器，并通过改变柱温、流速、流动相组成等参数进行方法优化。
最后，通过验证方法的准确性、精密度、线性范围、灵敏度、选择性和稳定性等指标，验证了该方法的可靠性和有效性,以期为多组分药物配方的高效液相分析方法的开发与验证提供了有效的指导。
关键词：多组分药物配方；高效液相分析方法；开发；验证前言高效液相分析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物配方的开发与验证中。
随着多组分药物配方的研究和开发的不断深入，对于高效液相分析方法的开发与验证的需求也越来越迫切。
一、多组分药物配方的高效液相分析方法开发1.1 样品制备首先，根据分析目的选择合适的样品，例如药物配方中的多个组分。
然后，根据样品的特性选择合适的制备方法，例如溶解、提取、过滤等。
对于固体样品，可以使用适当的溶剂进行溶解，而对于液体样品，可以直接使用。
1.2 色谱柱选择根据药物特性和分析目的，可以选择不同类型的色谱柱，例如反相色谱柱、离子交换色谱柱、手性色谱柱等。
反相色谱柱常用于分离非极性或弱极性化合物，离子交换色谱柱常用于分离带电离子，而手性色谱柱常用于分离手性化合物。
1.3 流动相选择首先，根据样品的特性和分析目的选择合适的溶剂系统，例如水/有机溶剂混合物。
然后，通过优化流动相的组成和流速，可以实现更好的分离效果。
常用的优化方法包括改变溶剂比例、添加缓冲剂或离子对流动相进行调整，以及调整流速等[1]。
1.4 检测器选择在开发多组分药物配方的高效液相分析方法时，需要根据药物的特性选择合适的检测器。
液相及液质分析方法学的开发及验证.
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合 – 再进行方法优化 • 梯度/温度
Impact on Resolution Double N Double k Double α
16
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发! • 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查 • 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
4
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
用一个确定方法来挑战现实的分析环境 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ
5
一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
准确度（Accuracy）
浓度1: 60% 原料及制剂 浓度2:80% 原料及制剂 浓度3:100% 原料及制剂
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药 浓度3 原料药 浓度4 原料药 浓度5 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
液相及液质分析方法学的开发及验证
+ HN(CH3 )
2
电性(大部解离)
Base Base 对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
0.04 AU 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Minutes 8.00 10.00
pH 2.0
0.04 0.03 AU 0.02 0.01 0.00 0.00
双重保留机理:
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
O-Si O-Si 离子交换作用 OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si OO-Si O-Si O-Si O当流动相为 pH6O--Si 8时, 硅醇基带负 O-Si
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
Naphthalene
铝杂质含量 ~375 ppm Acenaphthene Tf USP = 6.5 Amitriptyline
5
15
25 Minutes
35
45
24
固定相
O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
27
固定相
丧失浸润现象： 100%水Fra bibliotek液中保留完全丧失
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
起始：填料完全浸润 － “Wetted”
停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 －“De-Wetted” 0
28
2 4 Vo：被分析物没有保留
液相及液质分析方法学的开发及验证
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药 浓度3 原料药 浓度4 原料药 浓度5 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
鉴别试验
+ + + -
+ + + -
* + +
* + * *
+ -
定量限
线性 范围
10
+ +
+
+ +
*
*
* *
-
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
HPLC及HPLC/MS分析方法的开发
及其在药物分析中的应用
李晓东 中国食品药品检定研究院 北京 100050 E-mail: xdli@
HPLC及HPLC/MS法 • 基于分离分析科学技术
– 小颗粒填料的色谱柱 – 以光谱、质谱技术作为检测手段
• 专属性、分离效率及灵敏度
+ HN(CH3 )
2
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
0.04
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固定相
丧失浸润现象： 100%水溶液中保留完全丧失
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
起始：填料完全浸润 － “Wetted”
停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 －“De-Wetted” 0
28
2 4 Vo：被分析物没有保留
6 Minutes
8
10
流动相
• 甲醇
– – – – 质子化溶剂 [氢键供给者] 洗脱能力较乙腈弱 粘度较乙腈高 低紫外波长下有吸收
+ HN(CH3 )
2
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
0.04
AU
0.02 0.00 0.00
pH 2.0
2.00 4.00 6.00 Minutes 8.00 10.00
0.04 0.03
13
液相色谱的方法开发
14
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合 – 再进行方法优化 • 梯度/温度
• 乙腈
– – – – 非质子化溶剂 [氢键接受者] 洗脱能力较甲醇强 粘度较甲醇低 低紫外波长下透光性好
29
流动相
2
1 3 4 10 11 5 6 7 5,7 6 3 4
1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB) 3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B) 5. 1-Pyrenesulfonic acid (A) 6. Imipramine (B) 7. Amitriptyline (B) 8. Flavone (N) 9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB) 10. Diclofenac (WA) 11. Dioseb (A) 12. Octanophenone (N)
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真 实变化
11
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max 实验参数 2 Min & Max 实验参数 3 Min & Max 实验参数 4 Min & Max
线性 Day 1-3
定量限 精密度
定量限 原料药
12
方法验证的复杂性
• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即 可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
P D
Fl I A O
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
I A Fl O D
Fe
P
Fl
I O
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
鉴别试验
+ + + -
+ + + -
* + +
* + * *
+ -
定量限
线性 范围
10
+ +
+
+ +
*
*
* *
-
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
Silica pH Range Hybrid Particle pH Range
碱性
32
Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
Fl
C18 pH 3, ACN
I
A P Fe
D
O
C18 pH 10, ACN
Fe
8
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
9
方法验证- USP<1225>
类型2 验证的内容
准确度 精密度 专属性 检测限
类型4
类型1
定量
限度试验
类型3
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
31
流动相pH值
40 35 Retention Factor (k) 30 25 20 15
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响
酸性
酸性保留增强 [HA]
中性化合物
碱性保留增强 [B]
10
5 0 0 2 4 6 pH 8 10 12
浓度1: 60% 原料及制剂 浓度2:80% 原料及制剂 浓度3:100% 原料及制剂
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药 浓度3 原料药 浓度4 原料药 浓度5 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
7
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 拖尾因子
– T2
• 精密度/进样重复性 • RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
双重保留机理:
与键合相的疏水性作用
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
O-Si O-Si 离子交换作用 OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si OO-Si O-Si O-Si O当流动相为 pH6O--Si 8时, 硅醇基带负 O-Si
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品 分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
Fe
A
P
D
33
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
Impact on Resolution Double N Double k Double α
16
影响分离度的因素
17
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发! • 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查 • 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
% Improvement 20 – 40% 15 – 20% > 400%
Maximized in UPLC Separations by:
Ultra-low dispersion system Small [< 2 µ m] particles Higher pressure capability Well-designed columns
4
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
用一个确定方法来挑战现实的分析环境 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ
5
一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
准确度（Accuracy）
去甲阿米替林
AU
0.02 0.01 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00
pH 7.0
阿密曲替林
4.00 Minutes
5.00
6.00
7.00
8.00
26
固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少 95% ，因此，降低被分析物的保留 时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
Naphthalene
铝杂质含量 ~375 ppm Acenaphthene
Tf USP = 6.5