生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展

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抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用

抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用概述：抗菌肽（Antimicrobial Peptide，AMP）是由真核生物和原核生物产生的一类广谱抗菌活性肽。

抗菌肽MET是一种新型的AMP，对多种细菌、真菌和寄生虫展示了显著的抑菌活性。

近年来，越来越多的研究关注抗菌肽MET在微生物学领域的应用。

本文旨在探讨抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用。

一、抗菌肽MET的特性抗菌肽MET是一类具有亲水性的小分子多肽，通常由20个左右的氨基酸残基组成。

其具有多种特性，如低分子量、对广谱微生物具有高度抗菌活性、快速杀菌等。

此外，抗菌肽MET在生物体内短暂存在，并且对抗生物耐药性展示出较低的概率。

二、抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种常见的真菌，在生命科学和食品工业中具有重要的应用价值。

研究表明，抗菌肽MET能够在毕赤酵母中实现表达，且其表达量与MET基因的启动子的选择和表达强度密切相关。

通过适当的基因工程技术，可在毕赤酵母中构建MET基因表达系统，从而实现高效表达抗菌肽MET。

三、抗菌肽MET与抗生素的体外联合抑菌作用近年来，多重耐药微生物的出现使得传统抗生素治疗失去了效果。

因此，探索新型抗菌药物和联合治疗策略变得尤为重要。

抗菌肽MET与抗生素的联合使用已成为一种备受关注的策略。

实验证明，抗菌肽MET与常用抗生素如青霉素、庆大霉素等能够呈现协同抑菌作用，使得微生物对抗生素的耐药性得到抑制。

此外，抗菌肽MET还能增加细菌膜对抗生素的渗透性，提高抗生素内部靶位的浓度，并通过干扰细菌的生物膜、破坏细菌的DNA和RNA合成等机制增强抗生素的抗菌效果。

四、抗菌肽MET的应用前景抗菌肽MET作为一种新型抗菌药物，具有广泛的应用前景。

其作为微生物学领域的抗菌剂，不仅能够杀灭常见的细菌和真菌，还能有效对抗抗生物耐药菌株。

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权，陈薇，来大志，于长明，王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2002,22(6)被引用次数：11次1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04)2.查看详情3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 19924.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris[外文期刊] 2000(1)5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29)6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08)7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03)8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04)11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02)12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 199713.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1)14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊]2001(04)15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)16.Werten M W;van den Bosch T J;Wind R D High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris 199917.Callewaert N;Laroy W;Cadirgi H Use of HDEL tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1 2 alpha D mannosidase for N glycan engineering in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(23)18.Hilario E;Lataro R C;Alegria M C High level production of functional muscle alpha tropomyosin in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)19.Choi B K;Jimenez Flores R Expression and purification of glycosylated bovine betacasein(L70S/P71S) in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)20.Borgheresi R A;Palma M S;Ducancel F Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(08)21.Cregg J M;Cereghino J L;Shi J Recombinant proteinexpression in Pichia pastoris[外文期刊] 2000(01)1.张伍魁.范清林.宋礼华.ZHANG Wu-kui.FAN Qing-lin.SONG Li-hua毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[期刊论文]-中国生物工程杂志2006,26(1)2.隋少飞.陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通报2004(3)3.龙晶.杜立新.LONG Jing.DU Li-xin巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展[期刊论文]-微生物学杂志2007,27(6)4.黄石.邹民吉.徐东刚毕赤酵母分泌表达系统的研究进展[期刊论文]-医学研究通讯2004,33(7)5.杨梅.温真.林丽玉.杨彩云.Yang Mei.Wen Zhen.Lin Liyu.Yang Caiyun毕赤酵母蛋白表达系统研究进展[期刊论文]-生物技术通报2011(4)6.樊建勇.王刚.刘玉峰毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)2003,26(5)7.韩雪清.刘湘涛.尹双辉毕赤酵母表达系统[期刊论文]-微生物学杂志2003,23(4)8.彭彦孟.连继勤毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国际检验医学杂志2007,28(7)9.欧阳立明.张惠展.张嗣良.刘志敏.OUYANG Li-Ming.ZHANG Hui-Zhan.ZHANG Si-Liang.LIU Zhi-Min巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[期刊论文]-生物化学与生物物理进展2000,27(2)10.娄瑞娟.罗利龙.张霞.张瑞刚.宋水山.LOU Rui-juan.LUO Li-long.ZHANG Xia.ZHANG Rui-gang.SONG Shui-shan巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望[期刊论文]-生物学杂志2010,27(5)1.张旦旦.窦文芳.许正宏.史劲松基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化[期刊论文]-中国医药工业杂志 2012(9)2.张淑琼.高娟.曾思遥.蒋再学.陈瑞爱.罗满林犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究[期刊论文]-中国畜牧兽医 2012(8)3.窦文芳.张旦旦.许泓瑜.金坚.许正宏.史劲松.陆震鸣提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达：人干扰素毕赤酵母表达体系研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2011(11)4.曾松荣.王艳萍.杨明重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究[期刊论文]-中国生物工程杂志 2008(10)5.朱骞.张汇东.葛菲菲.缪勤.曹瑞兵.陈溥言.徐汉坤犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定[期刊论文]-农业生物技术学报 2007(4)6.蔡梅红.张素芳.曹瑞兵.郭伟玲.陈溥言重组酵母鸡γ干扰素的抗病毒活性测定及临床初步应用[期刊论文]-微生物学报 2006(1)7.曹瑞兵.周国栋.周海霞.包晶晶.陈溥言猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用[期刊论文]-微生物学报 2006(3)8.龙元.刘钟滨基因工程植酸酶表达的优化途径和方法[期刊论文]-同济大学学报（医学版） 2006(z1)9.季刚鼠抗人CD2基因工程抗体嵌合Fab的构建和表达[学位论文]博士 200610.肖生科.王磊.陈毓荃提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展[期刊论文]-生物技术通报 2004(2)11.赵玉美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及叶片中抗病毒蛋白的分离[学位论文]博士 200412.王强应用建立的DNAshuffling配套技术平台改良tPA分子性质的研究[学位论文]博士 200413.曹瑞兵重组猪α、β和γ干扰素的研制及其抗病毒作用[学位论文]博士 2004本文链接：/Periodical_swgcjz200206010.aspx。

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

第３２卷第２期
２１年２月００
中国预防兽
医学报
Ｖ０．１３２．ｏ２Ｎ．Ｆｅ．２０ｂ０ｌ
ＣｉｅｅＪｕａｏｒｖｎｉｅＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅｈｎｓｏｒｌｆｅｅｔｔｒｎｒｄｃｎｎＰｖ
酵母细胞ＳＭＤ１６。经Ｚｏｉ抗性筛选，得到高拷贝转化子，ＰＲ检测表明Ｌ一１８ｅｃｎＣＬ３７基因与毕赤酵母染色体稳定
结合在ＧＰ启动子调控下，Ｌ．ＡＬ３７蛋白获得分泌表达，其上清表达量约为２７／。表达产物耐热性强，在３Ｌｍｇ１０℃ 条件下３ｎ内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌Ｄ５、大肠杆菌Ｄ１猪链球菌的最小００ｍｉＨ３和
ＡｂｔａｔｎｏｄｒｔｍｐｏｅｅｐｅｓｏｆａｔｃｏｉｌｐｐｉｅＬＬ３ｎＰｃｉａｔｒ，Ｌ一７ｇｎｓｄｓｎｄａｄｓｒｃ：Ｉｒｅｏｉｒｖｘｒｓｉｎｏｎｉｒｂａｅｔ一７ｉｉｈａｐｓｉＬ３ｅｅｗａｅｉｅｎｍｉｄｏｇｓｎｈｓｚｄｔｎｌｄｈａｔｌｙｃｄｎｆＰａｔｒａｅｎｔｅｇｎｅｕｎｅｎｏｉｇｈｍａｎｉａｔｒａｐｐｉｅｙｔｅｉｅｏｉｃｕｅｔｅｐｒａｉｏｏｓｏ．ｐｓｉｂｓｄｏｈｅｅｓｑｅｃｓｅｃｄｎｕｎａｔｃｅｉｌｅｔｉｔｏｓｂｄＬ一７Ｌ３．ＴｅｍｏｉｅＬ一７ｅｅｈｄｆｄＬ３ｇｎｗａｃｏｅｉｔｔｅＧＡＰ【ｉｓｌｎｄｎｏｈｐＺｏＡｖｃｏｎ￣ａｓｒｄｎｏ．ｐｓｏｉＭＤ１６ｂｅｔｒａｄｎｆｍｅｉｔＰｏａｔｒＳｓ８ｙ１

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。

它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。

目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。

毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。

此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。

因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。

例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。

毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。

比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。

利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。

总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。

毕赤酵母表达研究进展

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展

700
中国病原生物学杂志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol. 4, N o. 9 J ournal of Pathogen Biology
综述生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
孔凡红, 仲维霞, 崔勇, 王洪法*
*!
通讯作者 ! E m ail: w an g_hongf a@ yahoo. com. cn 作者简介 ! 孔凡红 ( 1984- ) , 女 ( 汉族 ) , 山东邹城人 , 在读硕士 ,
主要从事生物制品的研究。 E mail: k on gfan1025@ 163. com
中国病原生物学杂志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol . 4, N o. 9 J our nal of Pathog en Biology 表达系统有一定优点 : 成本低、易于操作、遗传背景清楚、能被大规模培养、有大量可供选择利用的克隆和表达载体。但运用该系统表达抗菌肽则比较困难 , 主要表现在 3 个方面 : 1) 大肠埃希菌是原核生物 , 不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质翻译后加工修饰能力 , 其产物往往形成没有活性的包涵体 , 须经过变性、复性等处理才能应用 ; 2) 抗菌肽的宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制大肠埃希菌的增殖 , 影响抗菌肽的进一步表达 ; 3) 容易被降解。抗菌肽本身带有大量的正电荷 , 对蛋白酶非常敏感 , 在大肠埃希菌中容易降解 , 难以实现大量表达。因此抗菌肽基因只能以融合蛋白的形式在大肠埃希菌中表达。但也不乏有成功的例子 , 目前已有多种抗菌肽进入 # 期临床试验阶段 [ 6] ; 用脂质体包装的 2 螺旋型阳离子肽 CM 3 喷剂也已完成用于治疗支气管和肺部感染的临床实验

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

1 P． pastoris 表达系统的特点
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目：福建省科技厅资助项目（ 2009N0032），福建省教育厅资助项目（ JA08041）作者简介：杨梅，女，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰素（ cIFN）的表达量达到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida）和汉逊酵母属（ Hansenula）等。毕赤酵母（ P． pastoris）作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势，其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。

毕赤酵母表达系统研究进展

中图分类号：Ｑ８１５文献标志码：Ａ文章编号：１６７４－８６４６（２０１３）０９－－００２７－０５
ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｓｙｓｔｅｍ
第４卷第９期
２０１３年９月
黑龙江科学
ＨＥＩＬ０ＮＧＪＩＡＮＧＳＣＩＥＮＣＥ
Ｖ０Ｉ．４Ｎｏ．９
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ．２０１３
毕赤酵母表达系统研究进展
马银鹏，王玉文，党阿丽，孔祥辉，张介驰＇
ＭＡＹｉｎ — ｐｅｎｇ，ＷＡＮＧＹｕ — ｗｅｎ，ＤＡＮＧＡ．１ｉ，ＫＯＮＧＸｉａｎｇ．ｈｕｉ ’ ，ＺＨＡＮＧＪｉｅ — ｃｈｉ＇
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇ］ｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００１０，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｓｔｎｉｔｕｔｅｆＡｏｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｅｉｌｏｎｇｉｆａｎｇＡｃａｄｅｍｙｆＳｏｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００２０，Ｃｈｉｎａ）
（１．黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨１５００１０；２．黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨１５００２０）

抗菌肽基因表达系统研究进展

点突变的方法改变某些碱基但对于抗菌肽小分子而言这两种方法均显繁琐由于分子量小直接根据表
、
，
的
TCG
、
抗菌活性的组分无疑是
一
件非常繁琐
作且不同
．
，
编码 Le
，
的 CT G CT A 等其使用频率几乎是 0
。
的实验条件对于组分的纯度影响很大
，
天然存在的抗
般来说含有较高比例的稀有密码子 f或稀有密码
，
菌肽产量很低无法从动植物体内大量提取：而化学合成肽价格昂贵所以国内外都将目光瞄向利用基因
文中进行了简要综述
关键词
抗菌肽；基因表达；大肠杆菌；毕赤酵母
S 8 16 1 5
．
中图分类号
抗菌肽 (A n t i b a
、
c
te
r
i a l p e p t ide )是
生物细胞特定基
一
同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试涉及的表达
营
> 饲《硝 I ~ > 2 0 0 9 垂塑璺堂璺 Z 塑 Q
-
目
抗苗肽基因襄达蔡统研究进展
唐摘
要
抗
勇
，
菌肽是生物体产生的
，
一
种阳离子短肽具有天然的抗菌活性

抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究

抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究引言：抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽类物质，这些肽在自然界中广泛存在于动植物和一些微生物中。

由于其天然来源、低毒性、高效率等特点，抗菌肽被广泛应用于食品、医药、农业等领域。

然而，抗菌肽的大规模生产受到了许多因素的限制，如成本、稳定性等。

因此，酵母异源表达系统成为抗菌肽及其他功能蛋白高效率制备的理想平台。

本文将介绍抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究现状和挑战。

一、抗菌肽的酵母异源表达1.1 酵母异源表达系统简介酵母是一类简单的真核生物，其异源表达系统具有优异的蛋白质表达性能和机制研究条件。

常用的酵母包括酿酒酵母(酮酸酸酯酵母)，毕赤酵母等。

酿酒酵母是一种广泛应用于工业生产中的真菌，具有优秀的产酒性能和设备基础。

因此，酿酒酵母常被选为抗菌肽异源表达的宿主菌株。

1.2 抗菌肽的酵母异源表达策略抗菌肽异源表达的主要策略分为两类：短肽策略和全长策略。

短肽策略通过合成或克隆抗菌肽编码基因的短序列至酵母基因中，将其表达于酵母细胞。

全长策略则采用克隆含有完整抗菌肽基因的表达载体，将其转化至酵母中。

两种策略各有优缺点，在不同情况下可根据需要选择适宜的表达策略。

1.3 抗菌肽异源表达困难与解决抗菌肽的异源表达常常面临以下困难：剧毒性、导入异源抗菌肽基因时的细胞毒性及失活等。

为解决这些问题，研究者采用了许多策略，如信号肽重组、构建多基因拷贝操控系统、优化培养条件等。

这些改进方案显著提高了抗菌肽异源表达的成功率和产量。

二、酶类酵母异源表达的研究2.1 酶类在工业生产中的重要性酶类是一类在化学反应中起催化作用的生物催化剂，具有高效、特异性、低成本等特点。

在日常生活和工业生产中，酶类广泛应用于食品、制药、能源等领域。

因此，酵母异源表达酶类的研究具有重要的应用价值。

2.2 酵母异源表达酶类的策略酵母是一类优质的酶源，其异源表达系统具有高效稳定的表达性能。

常用的酵母异源表达构建策略包括直接表达、表面展示、分泌表达等。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展_王炎林

[ 1]
纯化. 毕赤酵母发酵培养的营养要求低, 且诱导物甲醇与其它表达系统诱导物相比十分廉价, 同时培养基中不含蛋白, 有利于表达产物分离纯化 . 安全性高 . 由于毕赤酵母不含有特异性病毒, 不产生毒素, 有些酵母菌属 (如酿酒酵母等 ) 在食品工业中有着几百年的应用历史 , 是非常安全的基因工程受体系统 . 大体积高密度连续发酵培养. 巴斯德毕赤酵母可以在简单的培养基 (包括盐、微量元素、生物素和碳源 )上良好生长 , 在甲醇诱导下进行大体积高密度连续发酵培养 , 表达水平稳定, 且能够在较宽的酸碱度 ( p H3 . 0~ 7 . 0) 变化下生长, 有利于在发酵过程中通过调节 p H 值来抑制蛋白水解酶活性 , 防止蛋白水解酶对蛋白的降解. 具有较强的且易控制的乙醇氧化酶基因 ( a lcohol ox idase , AOX ) 启动子 , 可严格控制外源基因的表达. 作为真核表达系统 , 可对目的蛋白进行翻译后加工和修饰 , 即信号肽剪切、二硫键形成、蛋白的糖基化和磷酸化等过程 , 以使外源蛋白得到正确的折叠和修饰. 由于该表达系统有多种受体菌和表达载体供选择 , 进行胞内表达或分泌表达, 有利于产物的提取和加工等.
AOX1 已被来自酿酒酵母的 ARG4 所代替, 只能依赖 AOX2 基因合成 AOX, 在甲醇中缓慢生长 . 重组菌和宿主菌用组氨酸和精氨酸筛选, 但重组菌 ( arg4) 在补充精氨酸的最低营养培养基中生长不良, 因此, 一般不推荐用 KM 71 产生 H is 转化子.
+
宿主菌 M C100- 3 的两个 AOX 基因都被去除 , 不能在含甲醇
巴斯德毕赤酵母表达系统已成为应用最广的外源蛋白表达系统之一 , 目前已有 400 多种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中得以成功表达 . 该系统具有以下独特的优点: 表达量高. 各种蛋白质在巴斯德毕赤酵母中的产生水平约为细菌或哺乳动物细胞等表达系统产量的 10~ 100 倍, 甚至有些蛋白可达到每升克以上水平. 稳定性高 . 由于巴斯德毕赤酵母无内源型载体, 一般目的基因通过同源重组, 可稳培养成本低 , 产物易分离定地整合在酵母染色体上 , 随染色体的复制而复制 , 构建的重组菌十分稳定 .

抗菌肽酵母表达系统的研究进展

抗菌肽酵母表达系统的研究进展李静;冯兴军;宋雪莹【摘要】抗菌肽是生物体内一类具生物活性的小分子多肽,由于从天然资源中提取成本高,得率低且化学合成价格昂贵,利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义.酵母表达系统具有表达量高,利于产物分离纯化等优点,利用酵母表达抗菌肽具有很好的前景.本文综述了毕赤酵母表达系统表达抗菌肽的最新进展.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2011(000)008【总页数】3页(P4-6)【关键词】抗菌肽;酵母表达;表达策略【作者】李静;冯兴军;宋雪莹【作者单位】东北农业大学动物科技学院;东北农业大学动物科技学院;东北农业大学动物科技学院【正文语种】中文【中图分类】S816.7抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分（Brogden和 Kim，2005），广泛分布于细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物以及人类体内（Robert，2001）。

抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用（Jin等，2006；Li等，2005）。

和抗生素相比，抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广、无耐药性和作用机制独特等特点，因此被认为是能够成为替代抗生素的首选药物。

近几年来，有关抗菌肽及其应用逐渐成为药理学、免疫学、分子生物学等领域研究的热点，抗菌肽在医药卫生、农业生产以及食品工业等领域都具有广泛的应用前景。

但其来源和制备是限制抗菌肽应用的主要瓶颈。

目前通过基因工程方法制备抗菌肽为其提供了手段，酵母表达系统在表达抗菌肽方面具有多方面优势，本文综述了酵母表达系统重组表达抗菌肽的最新研究进展。

1 抗菌肽概述依据其来源，可将抗菌肽分为微生物抗菌肽、植物抗菌肽和动物抗菌肽。

根据氨基酸形成和结构特征，可将抗菌肽分为4类：天蚕素类、防御素、蛙皮素、蜂毒素（Brahmacharym等，2004）。

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展
黄石;邹民吉;徐东刚
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2004(033)007
【摘要】毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用.本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素.
【总页数】3页(P34-36)
【作者】黄石;邹民吉;徐东刚
【作者单位】军事医学科学院基础医学研究所,100850;军事医学科学院基础医学研究所,100850;军事医学科学院基础医学研究所,100850
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展 [J], 姚晶;吴正钧;任婧
2.毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展 [J], 蒋慧慧
3.巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展 [J], 路蓉;安云庆
4.Neuritin毕赤酵母分泌表达系统的构建 [J], 朱井玲;汪海燕;王旭晖;黄瑾
5.毕赤酵母表达系统研究进展 [J], 马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰
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酵母表达系统概述及相关研究进展

酵母表达系统的研究进展和前景( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。

近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。

本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。

关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。

在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。

常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。

酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。

其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。

酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。

因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。

但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。

与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

第28卷第1期农业科学研究2007年3月　Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007文章编号:167320747(2007)0120068204巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴　润1,陈溥言3(1.宁夏大学农学院,宁夏银川　750021;　2.甘肃农业大学,甘肃兰州　730071;3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京　210095)摘　要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统.1　巴斯德毕赤酵母菌株一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].2　Pichi a p astoris表达载体载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.2.1　启动子Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择.2.2　选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选.2.3　信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的收稿日期:2006205220作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham 等也利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PG AP 启动下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].2.4　表达载体的种类Invit rogen 公司开发出了若干系列的表达载体可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体.如p HIL 2D2,p AO815,p PIC3K ,PICZ ,p HWO10,p GA PZ.②分泌表达载体.如p HIL 2S1,p PIC9K ,p PICZα,p GA PZ α[8].目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的.3　基因整合证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR 抑制细胞壁的形成,因此PICZ 系列不能使用原生质体法进行转化.转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的P AOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His +Mut -[9].②AOX1单位点互换.发生在染色体和表达质粒的AOX1区.产生的表型是His +Mut +.③His 单位点置换.发生在染色体His 位点和表达质粒的His 位点,使得1个或多个表达单位插入在His 位点,产生的表型也是His +Mut +.巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量.4　重组蛋白翻译后修饰Pichi a p astoris 能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O 2连接和N 2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下Pp 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].5　影响外源基因表达的因素影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等[14].5.1　外源基因自身的特性外源基因在P.p 中表达时,其自身就是影响表达水平的重要因素.许多高A +T 质量分数的基因常会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA 5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因的正常表达.Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白的mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,HSA 的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证明,Pichia pastoris 有密码子偏爱倾向[16].所以一般需要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密码子用法和具有更高的G +C 质量分数.5.2　表达框染色体整合位点巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白.Sreekrishna 等认为,由于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转换,所以首选aox 1位点作为整合位点.5.3　宿主菌的甲醇利用表型原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut -细胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表达载体p GA PZ 和p GA PZα已经构建成功,它们常能生产比诱导型载体p PICZ 和p PICZα更高的外源96　第1期魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运蛋白时,p GA P比pAOX1更理想.5.4　基因剂量一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.5.5　分泌信号不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子信号肽的表达载体p P IC9K.Singh等通过定向缺失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.5.6　发酵系统培养巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控p H、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的补料分批培养制度和连续灌注培养方法.5.7　产物稳定性酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培养基的p H值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163, SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.在另外一种情况下,如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话,也可能出现高度降解的情况.6　结束语巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统,具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点,而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在P Pichi a p astoris中得到表达.巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①巴斯德毕赤酵母表达载体整合后具有高稳定性.②可进行胞外表达和胞内表达,胞外分泌表达更有利于蛋白纯化.③发酵培养适合进一步大规模生产.④表达蛋白的加工修饰适中.但巴斯德毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进行进一步的研究和开发.参考文献:[1]　CREGG J M,CEREGHINO J L,SHI J,et al.Re2combinant protein expression in Pichia pastoris:a re2view[J].Molecular Biotechnology,2000,16(1):23252.[2]　CREGG J M,V EDV IC K T S,RASCH KE W C.Re2cent Advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris[J].Teclmology,1993,11(8):9052910.[3]　CREGG J M,MADDEN K R,BARRIN GER K J,etal.Functional characterization of the two alcoholoxi2dase genes f rom the yeast Pichia pastoris[J].MolCell Biol,1989,9:131621323.[4]　VASSIL EVA A,GHU GH D A,SWAMINA T HANS,et al.Expression of hepatitis B surface antigen inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris using theGAP promoter[J].J Biotechnol,2001,88:21235. 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抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达的研究

热和酸碱稳定、水溶性好、免疫原性和抗菌谱广等无
特点 … 更为重要的是，菌肽对正常的真核细胞几，抗乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞ｆ２］。天蚕素（ｅｒｐｎ是抗菌肽的一种，３～ｃｃｏｉ）由７３９个氨基酸组成，相对分子质量约４００ｋ，Ｂｍｎ０ｕ由ｏａ
ＡＨ，Ｓ电击法转化Ｈｃｉｐｓｒ受体菌Ｓ１６，ｈａａｔｉｏｓＭＤ８成１
功表达抗菌肽ＣｃｏｉＡ。ｅｒｐｎＤ
１材料与方法１１材料．
等惜古比天蚕Ｈａｐｒｃｃｏｉ中分离获得，ｌ从ｙｌｈａｅｒａ蛹ｏｐ是目前研究最清楚、效果最明显的抗菌肽。天蚕素抗菌肽有广谱的抗菌能力和抗病毒活性。此外，天蚕素还具有无残留毒性及病原体难以产生抗药性等
启动子的甲醇诱导型表达，它存在诸多不利因素，如
收稿日期：０９０一５；回日期：０９１－３２０ — ｌ０修２０ — １１基金项目：北京市重大科技计划课题（００００２００）Ｄ９１１４７００
保存；．ｌＤ５购自ＴＫＲＥｃｉＨａｏａａａ公司；表达载体
ＰＡＺ — 购于ＩｖｒｅＧＰａＡｎｉｏｎ公司。ｔｇ
１１２酶和试剂高保真的ｐｒｅｔＮ．．ｙｏｓＤＡ聚合酶、ｂ限制性内切酶、，ＮＴＤＡ连接酶、去磷酸化酶等工具酶